摘　要:　采用PCR-RFLP技术，检测了62例动脉粥样硬化性脑梗塞患者和79名对照者的C677T突变的基因型。结果发现, MTHFR基因C677T 突变型等位基因(V)频率在实验组和对照组中，有显著性差异(χ2＝4.41，P<0.05)；三种基因型频率在两组人群中均无显著性差异。基因型频率的相对风险分析，AV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高1.76倍；VV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高3.25倍。结果表明, MTHFR基因C677T突变型等位基因与动脉粥样硬化性脑梗塞有一定的关联，突变基因型增加了动脉粥样硬化脑梗塞的发病风险。

关键词:　亚甲基四氢叶酸还原酶基因;动脉粥样硬化性脑梗塞;PCR-RFLP

中图分类号:　Q986,R446　　文献标识码:　A　　文章编号:　0253-9772(1999)06-0013-16

Relation Between MTHFR Gene Polymorphism and

Arteriosclerotic Cerebral Infarction

TENG Lu1,　ZHAO Yong-bo2,　WANG Xin-chun2,

CHEN Bai-bin1,　ZHANG Gui-yin1

(1.Department of Medical Genetics,Harbin Medical University,Harbin150086,China

2.The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin150086,China) Abstract:　In order to detect the relationship between MTHFRgene C677Tpolymorphism and arteriosclerotic cerebral infarction, this study examined the genotype of 62 patients with arteriosclerotic cerebral infarction and 79 control subjects by PCR-RFLP. The result showed that there was significance difference between patients and control subjects in V allele frequency of MTHFRgene C677Tmutation (χ2＝4.41，P<0.05) and there was no difference between patients and control subjects in genotype frequency of MTHFRgene C677Tmutation. The relative risk for arteriosclerotic cerebral infaction of heterozygote (AV/AA) was 1.76 and that of homozygote (VV/AA) was 3.25. The study confirmed an association between mutated allele of the MTHFRgene C677Tand arteriosclerotic cerebral infarction, mutated genotypes increased the risk of arteriosclerotic cerebral infarction.

Key words:　Methylenetetrahydrofolate reductase gene;Arteriosclerotic cerebral

infarction;PCR-RFLP

　　MTHFR基因1994年定位于染色体1p36.3〔1〕, 至今已发现导致该酶缺陷的15种突变〔1～4〕。其中C677T突变导致酶的热不稳定性缺陷，可引起高半胱氨酸血症，后者与多种疾病的发病风险有关〔5〕。本研究应用PCR-RFLP技术分析了62例脑梗塞患者与79例对照者的基因型，探讨MTHFR基因C677T多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞的关系。

1　材　料　与　方　法

1.1　研究对象

　　病例组为依据全国第三届脑血管病诊断标准，经临床检查(病史、体征、生化检验、CT)确诊为动脉粥样硬化性脑梗塞患者62例；对照组为无血缘关系的健康个体79名。所有受检者均为无血缘关系的东北地区汉族。采取外周静脉血5ml，-20℃保存至提取基因组DNA。

1.2　引物

　　引物序列为 NCO-351: 5'-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC- 3'；NCO-352: 5' -CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT- 3'。

1.3　基因组DNA提取

　　按常规方法, 经蛋白酶K-SDS处理, 酚/氯仿抽提, 无水乙醇沉淀提取基因组DNA。

1.4　MTHFR基因特定片段的PCR扩增

　　PCR反应总体系30μl，包括4×dNTP 1.5μl (2.5mmol/L)；引物NCO－351、NCO－352各1μl (6pmol)；TaqI酶(PROMEGA)1.5U；模板DNA 5μl。

　　PCR扩增条件为: (1) 94℃预变性5分钟; (2) 30个循环扩增, 94℃ 30秒, 62℃ 30秒, 72℃1分钟; (3) 72℃延伸 5分钟。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(EB)染色检验扩增结果，以备下一步实验。

1.5　限制性酶切PCR扩增产物

　　TaqI酶切体系20μl, 包括PCR 扩增产物 10μl；TaqI (10U/μl)0.2μl；10×缓冲液2μl；ddH2O 7.8μl。酶切产物在65℃ DZKW-C型水浴锅中过夜。

1.6　电泳检测

　　12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，银染分析电泳结果。

2　结　　果

2.1　MTHFR基因C677T多态基因座的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

　　MTHFR基因C677T基因座基因片段经TaqI 限制性酶切后，可分出3种基因型。677基因座原有的C突变为T后可产生一个TaqI 限制性酶切位点。未突变纯合子(基因型AA)基因序列中无TaqI 限制性酶切基因座，所以仅见一条电泳带，134bp；突变纯合子(基因型VV)可见两条电泳带，分别为75bp、59bp；突变杂合子(基因型AV)可见三条电泳带，分别为134bp、75bp、59bp (见图1)。( MTHFR基因C677T突变，导致丙氨酸残基(Ala)变成缬氨酸残基(Val)，本研究用A表示野生型等位基因，V表示突变型等位基因) 。脑梗塞组与对照组的MTHFR基因型频数和基因型频率分布(见表1)。

图1　MTHFR基因TaqI酶切片段电泳图谱

1.pBR322/MSP I;2、4、9.V/V;3、5、8.A/V；6、7.A/A。

表1　脑梗塞组和对照组MTHFR基因型频数和频率分布

分　组 例　数 基因频率 等位基因频率

AA AV VV A V

脑梗塞 62 12

(0.194) 35

(0.565) 15

(0.242) 0.476 0.524

对　照 79 26

(0.329) 43

(0.544) 10

(0.127) 0.601 0.399 2.2　

实验结果的统计学分析

　　脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。

　　脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因的突变等位基因V频率经χ2检验，χ2＝4.41，P<0.05，有显著性差异。

　　脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型频率经χ2检验，AA: χ2=3.24，P>0.05；AV: χ2=0.05，P>0.05；VV: χ2=3.17，P>0.05， 三种基因型频率均无显著性差异。

　　脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型频率的相对风险分析，AV/AA：RR=1.76，AV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高1.76倍；VV/AA：RR=3.25，VV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高3.25倍。

3　讨　　论

　　脑血管疾病是严重风害人类健康的临床常见疾病之一。其发病率、患病率、死亡率均居神经系统各类疾病首位。在对脑血管疾病临床和基础多方面的研究中，取得了很多成果。但关于它的发病原因至今尚未统一认识。国内外许多权威文献都把脑血管疾病看作是具有多种共同风险因素的疾病〔6〕。自从70年代以来，日渐增多的文献报道提示, 血中增高的半胱氨酸浓度(高半胱氨酸血症)与各种动脉硬化性疾病关系密切。高半胱氨酸血症是独立于高血脂症、高血压、糖尿病、吸烟和年龄之外，动脉硬化性疾病的一个独立风险因素〔7, 8〕。

　　引起高半胱氨酸血症的重要因素之一是MTHFR缺陷。其中，MTHFR基因C677T突变与心脑血管疾病关系的研究有许多文献报道。绝大多数研究是有关冠心病和心肌梗塞的，但结论却大不相同。有的报道认为, C677T突变与冠心病或心肌梗塞有关，患者组与对照组有显著差异，有的研究却持否定观点〔9～14〕。国内外有关MTHFR基因C677T突变与脑血管疾病研究的文献报道极少。至1997年在国际权威期刊上发表的文章仅有两篇。一篇是Press等人以摘要形式发表的，认为二者有相关性，但其对照组仅有50例，而且纯合突变型的频率低于其它研究报道〔15〕。另一篇是Markus等人发表于《STROKE》上的研究论文, 认为MTHFR基因C677T多态性与脑血管疾病患者的血清高半胱氨酸含量及叶酸含量有确定关系，但未发现MTHFR基因C677T突变型纯合子和杂合子与脑血管疾病的发病风险有关；然而，基因型与高半胱氨酸含量、叶酸含量的相关性增加了突变型基因型也许仍是低叶酸摄入的脑血管疾病的发病风险因素的可能性〔16〕。

　　本文是有关MTHFR基因C677T多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞关系的研究。脑梗塞是重要的缺血性脑血管疾病，其主要的发病机理之一是动脉粥样硬化〔6〕。本研究应用PCR－RFLP技术对脑梗塞组和对照组分别进行了基因型分析。脑梗塞组和对照组的等位基因频率经χ2检验，两组之间有显著差异(P<0.05)。这说明MTHFR基因C677T突变型等位基因与动脉粥样硬化性脑梗塞发病有关联。脑梗塞组和对照组的相对风险性分析结果表明AV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高1.76倍，VV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高3.25倍。结果提示MTHFR基因C677T突变的基因型增加了动脉粥样硬化性脑梗塞发病的风险。

　　综合以上分析结果, 作者认为动脉粥样硬化性脑梗塞与MTHFR基因C677T突变基因型有一定的关系，突变型基因型增加了动脉粥样硬化性脑梗塞发病的风险。