活性氧（reactive oxygen species ，ROS）是调节血管结构和功能状态的重要信号分子，血管内皮细胞、平滑肌细胞和动脉外膜细胞等均可产生活性氧，活性氧过多却是动脉粥样硬化（atherosclerosis，As） 的危险因素之一。体内有多种酶参与了活性氧的生成，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate，NADPH氧化酶）、黄嘌呤氧化酶、脂氧合酶、线粒体呼吸链酶复合体和内皮型一氧化氮合酶等，研究表明NADPH氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体，NADPH氧化酶参与了 As的发生和发展过程。
1、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的结构特性及其表达
最早在吞噬型细胞（粒性白细胞、单核/巨噬细胞）中发现NADPH氧化酶，包含胞膜成分细胞色素b558（gp91phox和p22phox，其中gp91phox有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点）和胞浆成分p47phox、p67phox及小的GTP结合蛋白rac（单核细胞为rac1，嗜中性粒细胞为rac2）等五个亚组分。phox的晶体结构显示，p47phox的两个前后排列的Src同源区相互作用能抑制其与p22phox结合。当p47phox被磷酸化时这种抑制作用消失，胞质侧的亚组分易位到胞膜与细胞色素b558结合，且在rac的参与下激活NADPH氧化酶而启动呼吸链，爆发级联反应。最近又发现在非吞噬型细胞如血管平滑肌细胞、内皮细胞、动脉外膜细胞、成纤维细胞、心肌细胞、上皮细胞和脂肪细胞等也表达NADPH氧化酶的所有亚组分，其中p22phox在各种细胞中都高表达，gp91phox主要在单核细胞表达，而在内皮细胞、SMC和成纤维细胞中表达甚低。血管细胞NADPH氧化酶与吞噬型细胞NADPH氧化酶存在一些区别：①血管细胞NADPH氧化酶常以NADPH或NADH为电子供体，而吞噬型细胞氧化酶仅以NADPH为电子供体；②无刺激时血管细胞NADPH氧化酶也持续产生低水平的O2 _，在某些病理刺激下O2 _的水平能被上调，但其O2 _生成量仍远低于激活的嗜中性粒细胞所产生的O2 _，这可能是由于血管细胞NADPH氧化酶的表达量低于嗜中性粒细胞。Uwe等发现在人脐静脉内皮细胞和白细胞中p47phox和p22phox的表达无明显差别，而HUVECs中p67phox和gp91phox的表达却远低于白细胞（其中gp91phox的表达仅为白细胞的1%）；③在未受刺激的内皮细胞中大部分NADPH氧化酶亚组分在胞内表达，且功能性NADPH氧化酶亚组分与胞内的细胞骨架（细胞色素b558）相连处于组装前状态，这种状态能使NADPH氧化酶维持较低的活性而持续产生低水平的O2 _；④血管细胞NADPH氧化酶产生的O2 _大部分在细胞内，而吞噬型细胞NADPH氧化酶产生的O2 _ 却在胞外。
近年来至少发现了两种新的gp91phox同工酶家族即NOX（NADPH oxidase）和DUOX（dual oxidase）。现已发现的NOX家族有NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4、NOX5等成员。NOX1基因又名MOX1 （mitogenic oxidase）或NOH1（NADPH oxidase homologue），它位于X染色体上。 NOX1至少有三种剪切变构体（splice variants），即NOX1α（外显子1-13）、NOX1β（外显子1-10，12，13）、NOX1γ（外显子1-5，14）。NOX1主要在结肠表达，前列腺、子宫和VSMC也有少量表达；NOX2即gp91phox主要在粒细胞和单核吞噬细胞表达，而B淋巴细胞、内皮细胞和神经细胞也有少量表达；NOX3 主要在胎肾（fetal kidney）表达，可能与生长发育有关；NOX4主要在成年肾（adult kidney）表达，它可能作为一种敏感性氧感受器，此外，NOX4 mRNA亦在非吞噬型细胞（内皮细胞，SMC，成纤维细胞）中表达，而在单核细胞中表达很低。在血管细胞中，内皮细胞主要表达NOX4，而VSMC主要表达NOX4和NOX1。Wingler等发现将1μM血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，ANGⅡ)与大鼠VSMC系A7r5孵育4小时，NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平分别升高4倍和6倍，来自动脉阻力血管（resistance arteries）处的成纤维细胞和VSMC也表达NOX2。NOX5主要在睾丸、淋巴组织和脾脏表达，它可能参与了精子与卵子的融合、细胞增生以及细胞因子的分泌等。DUOX1和DUOX2的氨基酸末端都有一过氧化物区域（an amino-terminal peroxide domain），目前在甲状腺、唾液腺、直肠、气管和支气管中发现有其表达，它们在甲状腺中表达可能与甲状腺激素的生物合成有关。
2、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活化信号通路
血管细胞中NADPH氧化酶被认为是产生活性氧的重要酶之一，它能被ANGⅡ、凝血酶、机械力、各种炎性细胞因子和生长因子激活。目前对ANGⅡ研究较多，ANGⅡ与ANGⅡ1型受体(angiotensinⅡ type 1 receptor,AT1-R)通过与G蛋白α亚单位（Gα）结合而激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），继而生成三磷酸肌醇 （inositol trisphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DG）。IP3可介导钙离子的释放并与DG一起激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)，使p47phox磷酸化而激活NADPH氧化酶，启动活性氧的生成。而且，释放的钙离子能激活磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2 ）而生成脱脂酸磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）和花生四烯酸（arachidonie acid，AA），LPC和AA均能增加NADPH氧化酶的活性。ANGⅡ也能通过与G蛋白βγ亚单位结合而激活Src激酶，活化的Src能激活上皮生长因子受体（epidermal growth factor recetor，EGFR）、蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）、Rac和 磷脂酶D（Phospholipase D，PLD），并进一步激活磷酸肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K）而生成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol3,4,5-triphosphate,PIP3），最终使rac-1活化并易位到胞膜，协助NADPH氧化酶的组装，启动活性氧生成。生成的活性氧又能激活EGFR，加速活性氧生成，形成正反馈循环。
2.1 蛋白激酶C
现已证明PKC介导的p47phox的磷酸化对吞噬型细胞NADPH氧化酶的活化很重要。在非吞噬型细胞VSMC中加入PKC抑制剂Ro31-8220、chelerythrine、calphostin C或GF109203X均能降低由血小板来源的生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）或ANGⅡ诱发的活性氧生成。GF10920也能降低由LPC诱发的raf-1和细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinases1/2， ERK1/2）磷酸化而介导的活性氧生成。在内皮细胞中加入calphostin C，chelerythrine或PKC-ζ特异性抑制剂能抑制由肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱发的p47phox易位，PKC-ζ特异性抑制剂还能阻断由TNF-α诱发的p47phox磷酸化及其与gp91phox的结合。相反，在没有p47phox激动剂时若激活PKC-ζ能增加p47phox磷酸化。因此，PKC可能通过促进NADPH氧化酶亚单位的磷酸化和易位来激活血管细胞NADPH氧化酶而影响活性氧的生成。
2.2 磷脂酶D
脂质代谢物可能参与了血管细胞NADPH氧化酶的活化。外源性磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和由激活的PLD产生的内源性PA均能显著增加VSMC内NADPH氧化酶活性。将非特异性PLD抑制剂sphinganine或suramin与VSMC一起孵育，能降低由ANGⅡ诱发的活性氧生成,而加入PA能恢复活性氧的生成。NADPH氧化酶抑制剂二甲苯基碘（diphenylene iodonium，DPI）能阻断由外源性PA介导的信号途径。PLD可能通过DG或生成PA而激活血管细胞NADPH氧化酶。PA和DG也能通过刺激PKC途径而激活NADPH氧化酶。最终，DG及其代谢物被水解成NADPH氧化酶的另一种强激动剂 AA。
2.3 磷脂酶A2
研究发现，当PLA2被激活时自由脂肪酸和LPC生成增多。加入外源性PA能激活吞噬型细胞NADPH氧化酶，而加入AA或亚油酸也能增加VSMC中NADPH氧化酶活性。在内皮细胞和VSMC中加入外源性LPC也能激活NADPH氧化酶而使活性氧生成增多。而且，在内皮细胞中加入PLA2抑制剂能减少由凝血酶诱发的活性氧生成，抑制AA的代谢能显著降低内皮细胞和VSMC内由ANGⅡ或凝血酶诱发的活性氧生成。这些结果表明，血管细胞中由PLA2介导的脂质代谢物也参与了NADPH氧化酶的激活。
2.4 rac
rac是吞噬型细胞中NADPH氧化酶的重要激动剂之一。ANGⅡ、去极化剂和凝血酶在增加VSMC和内皮细胞NADPH氧化酶活性的同时，也增加rac表达及GTP酶活性。Statins可能通过抑制rac GTP酶活性及其易位而抑制VSMC中NADPH氧化酶的激活，从而降低由ANGⅡ或EGFR诱发的活性氧的生成。在内皮细胞中抑制小G蛋白Rho家族如rac能降低活性氧生成。在rac表达缺陷的转基因鼠或细胞中，由机械力、PDGR或ANGⅡ诱发的活性氧生成明显受抑，相反，rac过表达却能增加由ANGⅡ诱发的活性氧生成。
3、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在As发生和发展过程中的作用
正常情况下，细胞所具有的抗氧化机制如过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）可清除活性氧，维持细胞氧化还原自稳态。当某些因素作用于细胞使这一稳态失调，活性氧产生的速率大于清除的速率时，就会造成活性氧的蓄积。过多的活性氧 可能通过增加钙离子水平来激活胞内信号通路和改变细胞内蛋白的氧化还原状态，使脂质氧化、黏附分子表达、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）激活、内皮细胞功能失调/凋亡、VSMC增生和迁移以及血管收缩性改变，最终导致As的发生与发展。细胞内活性氧来源多种多样，如 O2_ 、H2O2、HO·、脂自由基、ONOO-、含巯基的自由基等，体内有多种酶参与了活性氧的生成。NADPH氧化酶是一种多亚单位酶复合体，是细胞中一种可诱发的电子传递系统,可将电子从NADPH传递给O2而生成O2- (2O2+NADPH?2 O2-+NADP + H+)，最新的研究表明NADPH氧化酶和新发现的NOX蛋白家族与 As的发生以及As病灶的严重程度密切相关。
3.1 损伤血管内皮
正常生理条件下，体内的抗氧化防御机制能使一氧化氮（nitric oxide，NO）与O2_ 保持平衡，而各种病理状态可打破此平衡而使血管内皮细胞功能失调。内皮细胞功能失调即依赖内皮的血管舒张功能下降被认为是As的危险因素之一。有生物活性的NO是主要的内皮舒张因子。NO的生物活性下降可能与eNOS表达降低、eNOS底物缺乏、胞内信号改变以及活性氧增多而加速NO的降解有关。 研究发现高胆固醇喂养的兔血管eNOS功能是完整的，当用乙酰胆碱或钙离子载体A23187刺激时能激活eNOS，使NO生成增多。而用多聚乙烯-羟乙酸盐-超氧化物歧化酶（polyethylene-glycolated-SOD）治疗高胆固醇喂养的兔，能显著改善其血管舒张功能，但对正常组没影响。这可能是由于高胆固醇血症时NADPH氧化酶被激活使O2_生成增多，增多的O2_ 可抑制内皮细胞中NO合酶活性并加速NO的降解而使有生物活性的NO减少，增多的O2_ 也可与细胞内多不饱和脂肪酸发生氧化作用，导致胞膜正常结构被破坏，SOD可将过多的O2_转化为H2O2而增加NO的生成，改善血管舒张功能。Tomasz等通过检测133例冠脉搭桥手术病人的隐静脉中过氧化物生成和NADPH氧化酶活性发现，NADPH氧化酶是人隐静脉中生成过氧化物的主要酶体之一，它的活性增高能使依赖NO的内皮舒张功能失调，且能增加患As的危险性。Wingler等发现在肾素-血管紧张素系统活性高表达的转基因雄性大鼠的主动脉和肾脏中，NOX1 mRNA、NOX4 mRNA和NOX4蛋白水平较野生型大鼠明显增高，由NOX1和NOX4介导的O2_ 生成增多能灭活NO而使内皮功能失调，加速心血管疾病的发展。本实验室用高浓度AngⅡ与人脐静脉内皮细胞共同孵育发现，AngⅡ处理组的NOX4 mRNA表达增高且细胞内活性氧生成增多，这表明NOX4可能参与了细胞内活性氧的生成。
3.2 促进低密度脂蛋白（LDL）的氧化
由于生成大量的活性氧，可使LDL发生氧化作用，形成ox-LDL，ox-LDL在As的发生发展中起极其重要的作用。当LDL穿过内皮细胞层时，由活化的NADPH氧化酶产生的O2-与LDL相互作用而引起LDL的氧化，由此产生的ox-LDL可能是泡沫细胞吞噬的ox-LDL的主要来源。而由ox-LDL诱导生成的亚油酸过氧羟自由基（linoleic hydroperoxy）和 烷氧自由基也能与NO作用而灭活NO。过多的O2-能与NO结合形成过氧化氮，过氧化氮是一种很强的氧化剂，它能氧化LDL,引起内皮细胞黏付分子表达、血管舒张功能下降、单核细胞渗透和 MMPs的激活，导致血管重塑。Alexandra等发现低浓度（5μg/ml）的ox-LDL能诱导O2-生成而促进HUVECs增生。加入NADPH氧化酶抑制剂DPI或将p22phox的反义寡核苷酸转染到细胞都能大大减少O2-生成，这说明低浓度的ox-LDL可激活NADPH氧化酶使O2-生成增加而促进HUVEC增生。Uwe等发现ox-LDL诱发HUVECs中NOX2的表达和过氧化物释放有短暂的剂量依赖关系，而冠脉疾病的患者用statins（3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂）治疗后能下调NOX2表达，这可能是statins 治疗后血清总胆固醇和LDL-胆固醇降低而使进入内膜的LDL减少，继而oxLDL形成减少有关。Tham等发现ox-LDL可通过激活人冠状动脉内皮细胞中NOX4而促进活性氧生成。因此，由活化的NADPH氧化酶生成的过多的活性氧能氧化LDL，而氧化的LDL又能促进NADPH氧化酶的活化，进而形成恶性循环，促进As的形成。
3.3 加速动脉粥样硬化的发展
研究发现人冠状动脉管壁的各种细胞都能生成O2_，且成纤维细胞、巨噬细胞、新生内膜和中膜的SMC、内皮细胞都有p22phox表达，p22phox表达与O2_生成有关。 有As病变的血管各层均有明显的O2_ 生成，以As斑块肩部O2_ 生成最明显，易破裂的斑块的O2_生成量较稳定斑块（含大量胶原、小量巨噬细胞）明显增高；同时有As病灶（atherosclerotic lesions）的冠脉p22phox表达远高于没病灶的冠脉，斑块肩部的巨噬细胞显示p22phox呈强表达。Warnhotlz等发现在有高胆固醇血症的兔主动脉中，O2_生成、NADPH氧化酶活性和AT1受体表达均明显增高，而用AT1受体拮抗剂Bay 10-6734治疗能抑制NADPH氧化酶活性，降低O2_生成，改善内皮功能，减少AS早期斑块形成。这说明p22phox可能通过生成O2 _而参与了As斑块的形成。NOX1可能通过诱导血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和MMPs的表达使活性氧生成增多而促进血管新生（angiogensis）和肿瘤形成（tumorigenicity）。用含反义NOX1 mRNA的腺病毒载体能完全抑制VSMC中由ANGⅡ或PDGF诱发的早期阶段的O2_生成，它也能抑制由ANGⅡ或PDGF诱发的P38有丝分裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和肌动蛋白调节激酶（actin-regulating kinase，Ark）的活化。将p22phox的反义寡核苷酸转染到VSMC能降低O2_生成。因此，NOX1可能与p22phox结合形成功能性细胞色素而激活NADPH氧化酶生成O2_，促进As的发展。
动物实验发现，将喂正常饮食（standard chow）或高脂饮食的ApoE-/-/p47phox-/- 小鼠和ApoE-/-小鼠的主动脉窦（aortic sinus）分别用油红O染色，它们的主动脉窦平均As病灶面积（mean aortic sinus lesion area）没有显著差异。但Patricia等对整个主动脉（从主动脉弓到分支处）进行油红O染色发现，在喂正常饮食或高脂饮食的ApoE-/-/p47phox-/- 小鼠组的总的As病灶较ApoE-/- 小鼠组均明显降低（其中喂正常饮食时ApoE-/-/p47phox-/- 小鼠组较ApoE-/- 小鼠组降低75%），但它们的血脂如胆固醇和甘油三酯水平没有显著差异。从野生型小鼠和p47phox缺陷型小鼠分离大动脉SMC后的研究发现在正常生理条件或受刺激时，p47phox缺陷型小鼠的SMC的O2_生成均较野生型明显降低，这表明p47phox可能通过参与O2_生成而促进As的形成，而各组的主动脉窦平均As病灶没有明显区别，可能是由于主动脉窦处的 As病灶发展迅速不易测出。Sorescu等通过检测20例心脏移植病人的冠状动脉NOX2 mRNA和NOX4 mRNA并依照美国心脏学会（American Heart Association，AHA）对As病灶的严重程度分类标准发现，NOX2 mRNA在As的第Ⅳ和Ⅵ阶段分别较第Ⅰ阶段增加3.9倍和8.6倍,NOX4 mRNA水平在As的第Ⅳ阶段是第Ⅰ阶段的2.3倍,但在最严重的As复合性斑块中NOX4 mRNA却只有第Ⅳ阶段的12.8%。进一步研究发现，NOX2和NOX4在人冠脉中表达广泛，而NOX1表达较低。在As斑块肩部和As病灶严重区NOX2均高表达，NOX2的高表达主要与动脉管壁中的巨噬细胞浸润增多有关，而在斑块脂质中心周围NOX4表达增高，N0X4高表达主要与As病灶处SMC（α-肌动蛋白表达呈阳性）在As不同阶段的比例有关。Katalin等发现大鼠颈动脉在气囊损伤后增多的O2_ 不是由浸润的炎性细胞产生而是由中膜和新生内膜的SMC以及动脉外膜细胞产生，且伴有NOX1、N0X4和NOX2的表达增高。这提示NOX2、NOX4和 NOX1可能都参与了As的形成和发展，它们的表达与As病灶的严重程度有关。
4、抑制剂对尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性的影响
以前研究较多的是以肽为基础的抑制剂。抗生素肽PR-39的氨基末端的26个氨基酸残基能与p47phox的SH3区（Src homology domain）结合，阻断p47phox与p67phox的结合而抑制NADPH氧化酶活性。它过去被用于心肌再灌注损伤时NADPH氧化酶的作用观察。但近来发现，PR-39还能结合其它含SH3区的蛋白，也能与膜脂相互作用。因此，它不是一种特异的NADPH氧化酶抑制剂。Pagano等设计出一种由HIV包被蛋白的9个氨基酸和gp91phox的9个氨基酸组成的嵌合肽（chimeric peptide）gp91ds-Tat，它能与p47phox结合而干扰p47phox与gp91phox的结合，是一种高效的依赖gp91phox的NADPH氧化酶抑制剂。它能调节内皮细胞中单核细胞趋化蛋白-1 （monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）的表达、气囊损伤后新生内膜的形成和由ANGⅡ诱发的高血压等，但gp91ds-Tat只能抑制含gp91phox的NADPH氧化酶，而对其它NOX如NOX1、NOX3、NOX4和NOX5无抑制作用。
近来发现了一些小分子如夹竹桃麻素（Apocynin）和DPI能抑制NADPH氧化酶的组装 ，但均是非特异性的。Raloxifene是选择性雌激素受体调节子家族成员（selective estrogen receptor modulators，SERMs），它可能作为雌激素受体拮抗剂抑制高胆固醇喂养兔的胆固醇聚集和脂质氧化，通过调节NO和钙离子依赖的信号通路而扩张冠状动脉。用Raloxifene处理的大鼠血管rac-1的活性和表达均降低，将Raloxifene与鼠主动脉SMC孵育能降低由ANGⅡ诱发的活性氧生成。然而，长期应用Raloxifene是否能改善血管舒张功能还有待研究。SI17834（苯吡喃的衍生物）和Azelnidipine（一种钙离子拮抗剂）都能通过抑制NADPH氧化酶活性而阻断内皮细胞中由TNF-α诱发的VCAM-1和IL-8的表达，且SI17834能减轻ApoE缺陷鼠的As病灶。Wassmann等发现Atorvastatin（3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂）能使自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）主动脉NOX1 mRNA表达下调，同时能上调主动脉过氧化氢酶mRNA，它还能抑制主动脉rac1的易位而影响NADPH氧化酶活性，降低O2_的生成而改善血管舒张功能。但其作用目前只在SHR模型上得到了证实。
5、展望
动脉粥样硬化是当前严重危害人类生命和健康的最主要疾病之一，而NADPH氧化酶在As发病中的作用，正日益为人们认识和重视。尽管目前众多学者对NADPH氧化酶在As发病中的作用做了大量研究，但对吞噬型细胞和非吞噬型细胞NADPH氧化酶结构和功能的异同、酶的亚单位结构及其相互作用、酶的活性调控机制和有效的特异性抑制剂还有待研究。在今后几年中，随着As和NADPH氧化酶关系的分子机制的进一步阐明，新的特异性NADPH氧化酶抑制剂可能为As的治疗带来新的前景。
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