1.泛素2蛋白酶体途径简介

    真核细胞主要有两种蛋白降解途径：一种是溶酶体途径,主要降解经胞吞进入细胞中的胞外蛋白质；另一种是非溶酶体途径，主要经细胞颗粒中的蛋白酶体降解泛素化的细胞内蛋白质。泛素2蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway ,UPP) 不仅是一种破坏陈旧或损坏蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。UPP 水解底物的主要步骤为：识别被降解的靶蛋白；多个泛素分子共价结合到蛋白质底物上形成多聚泛素链；通过26S 蛋白酶体复合物降解靶蛋白，同时释放游离的、可重新利用的泛素分子。

    1.1 泛素结合系统　　

    泛素(ubiquitin ,Ub) 存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76 个氨基酸残基的蛋白,游离存在或共价缀合到各种细胞浆、核及整合到膜蛋白上。目前发现参与泛素化反应的酶至少有E1 ，E2 ，E3 这三类：E1 即泛素活化酶(Ub activating enzyme) ，在ATP 的参与下，E1 以其活性位点半胱氨酸的巯基与泛素的C 末端生成高能硫酯键，使泛素活化；E2 即泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes ,Ubs)，是多个成员组成的蛋白家族,可接受E1传递来的Ub ，在E3 的参与下将Ub 转移到底物上；即泛素2蛋白质连接酶(Ub-protein ligase) ，它分为两类：含HECT 结构域的E3 和含环指结构域的E3，近来又发现一类含U2box 结构域的E3。它们直接或间接与底物结合，促进Ub 从与E2 的硫酯键中间产物转移到底物上，或转移到已与底物相连的Ub 形成Ub 链，作为底物降解的靶向性信号。

    1.2 26S 蛋白酶体系统　　

    26S 蛋白酶体是一个巨大的多亚单位的蛋白酶复合体，它可将多泛素化的蛋白质分解成3～22 个氨基酸残基的小肽段。它可分为一个19S 具有调节功能的调节颗粒(regulatory particle ,RP) 或PA700 和一个20S 具有蛋白酶体催化活性的核心颗粒(core particle ,CP) 。19S 调节颗粒目前已知的调节成分有19S 帽(cap) 和PA28 。19S 帽能与多聚泛素链结合而使底物蛋白变性，并协助底物进入蛋白酶体的水解中心 。20S 颗粒由4 个环状物构成，其中7 个同源的α亚单位和7 个同源的β亚单位分别组成α环和β环，两个α环在两侧，两个β 环在中间，四个环以α7β7β7α7 的顺序层叠成圆筒状的20S 颗粒。酶活性位点位于20S 圆柱体空心结构中心，水解中心有环内3 个残基Thr1，Lys33，Gly17 和N 末端自由氨基组成。α环的中心几乎是封闭的，这可以阻止蛋白质穿过α环进入含有催化中心的β 环内表面，7 个β亚单位中可能只有3 个具有催化活性，并构成部分催化核心。Ub 化的底物在26S 蛋白酶体中降解，Ub 可被去Ub 化酶(deubiquitinating enzymes ,DUBs) 从底物水解下来重新利用；Ub 化的底物也可被蛋白酶体转运到溶酶体进行降解。

    2.膜受体的泛素化及其作用

    泛素一般与底物的特异的赖氨酸残基Lys48 结合形成多聚泛素链而介导其进行蛋白酶体途径降解。而单一泛素分子与底物结合或泛素与底物的非Lys48 的其它赖氨酸残基结合而介导其非蛋白酶体途径降解功能，泛素在胞内体系统中有很多种功能:参与多种膜受体、转运子和某些通道的内化，将蛋白从高尔基体转运到核内体，分选蛋白进入囊泡和多囊泡体(multivesicular bodies，MVB) 以及病毒出芽。
   
    研究发现，某些受体的溶酶体降解依赖于蛋白酶体活性，抑制蛋白酶体活性能阻断受体的降解而促进受体的循环利用，这表明蛋白酶体可能参与了内化后受体到溶酶体的转运。

    2.1 膜受体的泛素化　　

    研究发现,酵母中G 蛋白偶联α因子受体ste2p 的胞质侧尾部的赖氨酸残基，可能作为泛素缀合位点介导受体内化。用突变酵母株end4 △抑制其胞吞，可导致胞膜上泛素化ste2p 的积聚。当ste2p 上SINDAKSS 序列中的赖氨酸残基发生突变时，其泛素化和内化均受抑制。研究发现，α 因子受体ste3p， ste6p 肽转运子、ABC 肽转运子、Gap1p 氨基酸透性酶,多药转运子Pdr5 、尿嘧啶透性酶Fur4p，Gal2p 半乳糖转运子和麦芽糖转运子等都需被泛素化，而经历依赖泛素的胞吞。在哺乳动物细胞中泛素系统被认为参与了几种膜蛋白的内化和下调，如上皮钠通道( Epithelial sodium channel ,ENaC) 、生长激素受体(growth hormone receptor ,GHR) 、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor , EGFR) 、集落剌激因子/ 受体(colony -stimulating factor/ receptor) 和某些免疫系统受体。上皮钠通道的α和γ亚单位被与酵母中泛素连接酶(E3) Rsp5p 同源的Nedd4 泛素化,泛素连接酶Nedd4通过WW 区域与ENaC 的PPXY 结构框架(motif) 相结合，而介导其胞吞。Liddlle’s 综合症就是因为PYmotif 发生突变而使质膜上通道激活，引起Na + 流动增加所致的遗传性肾性高血压。研究发现，在泛素活化酶E1 突变的中国仓鼠细胞(CHO2ts20) 中有非泛素化的GHR 在质膜侧积聚而转铁蛋白受体却不受影响。另有研究发现，将GHR 片段上所有赖氨酸残基突变成精氨酸(GHR2399K) 以防止其泛素化，但由双亮氨酸为基础的motif (DTDRLL) 仍能介导GHR2399K 的内化，且GHR2399K 招募GH 进入网格蛋白有被小窝的效率与野生型GHR 相同。这提示GHR 的胞吞不依赖于其自身的泛素化，但依赖于泛素缀合系统的活性。研究发现，泛素连接酶Cbl 参与了EGFR 的泛素化和下调PDGFR，ErbB21 及克隆刺激因子21 受体。c2Cbl 的N 末端独特的Src 同源区域(SH2) 能介导其与酪氨酸磷酸化受体结合，而它的C 末端含7 个富含脯氨酸的区域能与含SH3 区域的蛋白如Grb2，Nck 和Cbl 相关蛋白(CAP) 结合。Hadassa 等发现，c2Cbl 环型锌指结构对EGFR 的泛素化和下调很重要。在EGF 刺激下，c2Cbl 可能通过招募CIN85 ( Cbl 相互作用蛋白85000 ) 和en2dophilins(网格蛋白有被小泡的调节成份) 与激活的EGFR 形成EGFR2Cb12endophilin2SETA 多蛋白胞吞复合物而介导胞吞，它还可协助多聚泛素链结合到EGFR 上及内化后受体的转运和降解。James 等发现，在有泛素活化酶E1 突变的中国仓鼠细胞(CHO2ts20) 中，由能识别抗体Fc 部分的受体FcγRⅡA2GFP 介导的IgG 复合物的摄取被阻断，这提示免疫性受体FcRS 的胞吞需要其泛素化，从而首次发现了受体泛素化在免疫受体的内化中起重要作用。

    2.2 与依赖泛素的受体胞吞有关的motif 　　

    研究发现，有两种与泛素结合有关的motif：泛素相关区域(ubiquitin-associated domain ,UBA) 和泛素作用区(ubiquitin-interacting motif，UIM) 可能参与了某些蛋白的胞吞。UBA 可能直接与多聚泛素链结合，而UIM 被认为是以蛋白酶体亚单位S5a (Rpn10) 序列为基础的motif，它能与多聚泛素链结合。现已发现，有14 种酵母蛋白含有UBA/ UIM 区域，其中的几种蛋白的UBA/UIM 区域被认为在胞吞中发挥了重要作用，GHR 的胞吞与其D334 上游特异的10 个氨基酸序列：DSWVEFIELD 有关，这个序列被认为是依赖泛素的胞吞motif (ubiquitin2dependent endocytosis，UbE motif) 。它的某些重要氨基酸残基，如327 位的苯丙氨酸残基(F327) 和331 位的天冬氨酸残基(D331) 的突变会使内化效率大大降低，这表明GHR 上完整的UbE motif 对GHR 进入网格蛋白有被小窝(clathrin coated pits) 进行胞吞中起重要作用。Tyr579 可能是与PDGFR 胞吞有关的重要的氨基酸残基，它位于UbE motif 内,与GHR 中的Phe327 作用相似。其它几种蛋白如催乳激素受体、c2erbB22 、IgE 受体(FcγII ，CD23) 、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor VEGFR) 、胰岛素反应性葡萄糖转运子(Glut4) 、钾离子及钙离子通道等可能也具有潜在的UBE motif。Amy 等发现酵母的α因子受体(ste3p ) 的胞质侧尾部PEST 样序列(PEST2like sequence) ，对ste3p 的泛素化、胞吞及随后的降解都很重要。PEST 样序列中3 个赖氨酰残基可能是其泛素化结合位点，将3 个赖氨酰残基都进行突变，ste3p 的泛素化和胞吞会严重受损。

    2.3 UPP 在受体胞吞中的可能机制　　

    在酵母细胞中，泛素可能作为一种内化信号直接与胞吞系统相互作用。Susan 等发现，将泛素融合到胞质侧只有6 个氨基酸残基的α因子受体ste2p 片段(ste2p23032Ub) 上能促进其内化，且ste2p2Ub 嵌合蛋白的胞吞途径与野生型ste2p 相似。他们还发现，ste2p2 3212Ub (t12 =18.5min) 和Ste2p23402Ub (t12 =12.8min) 的内化速度快于ste2p23032Ub (t12=57.6 min)，这说明泛素与质膜的距离与内化速度有关,泛素与质膜相距越远越有利于其内化，泛素与质膜的结合方向以及其它一些机制也可能影响内化效率。泛素介导ste2p 内化可能与其折叠的多肽三维结构有关。泛素是一种简单的球形结构，它由五个折叠的β片层和一个α螺旋构成，突出球形的部分是由4 个氨基酸组成C 末端尾部。泛素包含一个疏水中心和几个表面的疏水patches ，而有两个patches 对内化很重要，其中一个patch 由Ile44，Leu8 和Val70 组成，另一个patch 由Phe4，Gln2 和Glu64 组成。将Ile44 和Phe4 突变成丙氨酸与破坏泛素空间结构一样会大大降低ste2p2Ub 的内化，而球形表面的其它氨基酸残基对内化影响较小。Terrell 等用ste3p2Ub 发现了与ste2p2Ub 相类似的结果。Rebeca 等研究发现，与哺乳动物Nedd4 和Itch 同源的泛素连接酶Rsp5p 可能在Ste2p 等多种膜蛋白的泛素化和内化过程中起重要作用。Rsp5p 包含一个氨基酸末端C2 区，三个WW 蛋白2蛋白相互作用区域和一个羧基未端hect催化区域，而WW 区域可能在胞吞中发挥重要作用，其区域中任何点突变都会阻碍Ste2p 的泛素化和内化。Rsp5p 在胞吞过程中可能有两种不同的作用：调节泛素化的货物蛋白或泛素化与胞吞机制相关的蛋白。而哺乳动物细胞，UPP 在胞吞中的作用机制尚不清楚。研究发现，GHR 的泛素化与招募到膜区域有网格蛋白包被的的GHR 相一致。GH 与GHR结合而使GHR 二聚化，招募并激活Jak2，Jak2 使GHR，STATs 以及其自身磷酸化，信号转导核内。E2和E3 可能作为接合素蛋白(adaptor protein) 或与连接蛋白AP2 相连而协助有被小窝形成加速内化。胞吞后GH 和GHR 复合物随后被转运到早期和晚期胞内体被蛋白酶和溶酶体降解。Martin 等发现阻断由网格蛋白介导的EGFR 的胞吞会导致EGFR 短暂停留在网格蛋白有被小窝内，且受体已被不可逆泛素化，这表明泛素化可能作为招募或使EGFR 停留在网格蛋白有被小窝的信号。受体泛素化也可能是一种能调节受体内化的修饰或是泛素化胞吞系统中的某些成分，通过改变蛋白活性诱导其构象改变，而协助有被小窝的形成加速内化。Adriano 等研究发现人类免疫缺陷病毒联合受体CXCR4 的羧基末端有与降解相关的motif (SSLKILSKGK)，将其motif 中的三个与其泛素化有关的赖氨酸残基进行突变，不影响CXCR4 的内化却能完全阻断其溶酶体途径降解,这提示受体的泛素化可能参与了内化后受体到溶酶体的转运。研究发现，EGFR 的下调以及内化后白介素22 受体的溶酶体降解能被特异性蛋白酶体抑制剂所阻断，这表明蛋白酶体可能参与了内化后受体到溶酶体的转运。而在溶酶体内降解的Met酪氨酸激酶受体和PDGFR 、神经生长因子受体(nerve growth factor receptor ,NGFR) 低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor2related protein ,LRP) 也发现有类似的结果。