血管新生(angiogenesis)是指在原有的毛细血管基础上通过血管内皮细胞的增殖与迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生的形式生成新的毛细血管的过程。血管新生在胚胎发育、创伤愈合、子宫内膜周期性增殖等生理状态及肿瘤、增殖性视网膜病变等多种病理状态中起重要作用。近年的研究发现:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块内常出现病理性新生血管，它们可以促进粥样硬化病变的发展,甚至诱发斑块内出血和斑块破裂及其并发症的发生。因此，抑制斑块内血管新生可能成为增强斑块稳定性，防治急性冠脉综合征的靶点，具有潜在的治疗意义。

    1.斑块内血管新生的研究方法及研究模型

    目前对斑块内血管新生的研究已较成熟，主要包括以下四种研究方法及研究模型。

    1.1 体内植入法：在C57小鼠腹中线皮下注入一种凝胶(matrigel)，其中可含有斑块提取物或促血管新生因子，这种水凝胶在小鼠体温下凝固，形成水凝胶塞(matrigelplug)，然后缓慢释放其中所含有的生长因子等物质作用于周围组织，经数天后陆续处死小鼠，将水凝胶塞与其相连的腹膜同时取出，最后通过切片观察水凝胶塞中的血管新生情况。这种方法是目前应用最广泛的研究血管新生的方法。

    1.2 体外鼠动脉环血管新生测定法：动脉环取自8至10周龄小鼠的胸主动脉(若要研究斑块内血管新生可取已形成斑块的动脉环)，去除周围纤维脂肪组织，将胸主动脉切成1mm长的环形片断，置于已覆盖有matrigel的12孔组织培养板上，再补加matrigel覆盖动脉环片断，动脉环片断在含有生长因子的缓冲液中孵育5天后，对动脉环进行拍照，再应用NIH成像软件对微血管生长面积进行定量分析。

    1.3 鸡胚绒毛尿囊膜测定法:人颈总动脉内膜切除标本中含有纤维肌性斑块和混合性斑块，经体外培育9天后植入鸡胚绒毛尿囊膜中，共同孵育2天后，采用10%福尔马林原位固定鸡胚绒毛尿囊膜，从而评价其血管新生：(1)通过计算4个同心圆上的新生血管数目来定量计算血管密度；(2)通过组织学切片观察斑块内血管新生。已有实验采用转化生长因子B1证实该实验模型研究斑块内血管新生的有效性。

    1.4 新生血管密度测定法：石蜡包埋动脉粥样硬化斑块标本，切片厚度为4μm，采用标准免疫组织化学ABC法进行染色。所有一抗均为单克隆抗体，DAB为着色剂，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。新生血管染色呈棕黄色或棕褐色，内皮细胞标志物CD34和CD31以及新生血管标记物因子染色均为阳性结果。计数方法为每张切片选择3个血管最多的区域，在400倍光镜下进行计数，取平均每个视野的新生血管数定为新生血管密度。新生血管的判断标准：不以红细胞的出现，也不以是否出现管腔来确定是否为新生血管，凡是染成棕黄色，数个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个新生血管，凡管腔较大，还有较厚肌层的血管均不计数。这种方法是各种研究斑块内血管新生的方法都需采用的基本技术。

    2.斑块内血管新生的影响因素

    2.1 缺血缺氧：实验研究已反复证实,缺血缺氧是引起斑块内血管新生的基本原因。正常组织与缺血缺氧组织的分界面可能在血管新生中起着最为关键的作用。缺血缺氧使内皮丝裂原及其膜受体增加，许多细胞因子及生长因子尤其是血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)家族某些成员表达增加，从而促进血管新生。

    2.2 炎症：只要存在炎症与应激，不论有无缺血缺氧，中性粒细胞和巨噬细胞聚集后释放某些促血管生成因子，引起血管新生。炎症时蛋白水解酶的释放和血管通透性的增加，使血管内皮与基底膜之间的连接松懈，十分有利于血管新生。许多证据表明炎症反应是斑块内膜血管新生的重要诱导因素。斑块内的新生血管周围存有大量的巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞,这些细胞均能刺激血管新生。这些新生血管近端有炎性细胞的渗出，意味着新生血管是炎性细胞渗入斑块的通路，活化的炎性细胞又可分泌生长因子和释放蛋白酶,使内皮细胞增殖和基底膜降解，进一步刺激斑块内血管新生，并由此激发了正反馈机制，促进斑块的发生发展,甚至诱发斑块内出血和斑块破裂。Karen等在载脂蛋白E基因敲除小鼠AS病变晚期应用血管新生抑制剂血管抑制(angiostatin)发现斑块内巨噬细胞的聚集明显减少，并且能阻断这种正反馈循环。

    2.3 药物:缺氧环境下内源性腺苷通过刺激腺苷受体而促进内皮细胞增生，诱导生成内皮生长因子。潘生丁是腺苷阻断剂，能提高腺苷水平。长期服用潘生丁能提高毛细血管密度。另有研究证明，参三七、硝酸酯、肝素、凝血酶及某些钙离子拮抗剂均有促血管新生的作用。

    2.4 机械因素：血管网血流的压力梯度增强，局部小动脉壁血管张力改变以及减切力的改变，影响内皮细胞的物理学分隔，促使内皮增殖，机械因素导致的血管新生随时间的延长而密度增大。

    2.5 高胆固醇血症、高血压及吸烟：1998年，Kwon等在高胆固醇血症猪模型上证明其冠状动脉壁的面积及滋养血管网的密度明显增加，并认为高胆固醇血症的猪冠状动脉存在滋养血管的增加，这可能是动脉粥样硬化早期血管重构的一部分，因而证明了高脂血症易患动脉粥样硬化可能与其促进血管新生有关。高胆固醇状态可能造成了中膜层组织相对缺氧状态促进滋养血管的形成。2002年Kai等在高血压鼠模型上观察到其外膜面积明显增加时伴随有外膜滋养血管的密度明显增加。2001年Heeschen等观察到尼古丁在体外诱导内皮细胞增长及管腔形成。在动脉粥样硬化及肺癌鼠模型上，也发现尼古丁促进病灶的生长与其促进血管生成的作用相关。进一步研究发现尼古丁通过烟碱型乙酰胆碱受体介导血管新生。因此，血管新生似乎是以上三种危险因素促进动脉粥样斑块形成和发展的共同途径。

    3.斑块内血管新生的发生机制

    3.1 生长因子:现已证实在人类动脉粥样硬化斑块中存在大量生长因子，包括VEGF、FGF家族、血小板源内皮细胞生长因子(PD－ECGF)、粒－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)等。它们的存在先于斑块内膜新生血管的发展，但大量生长因子表达区域与内膜新生血管区域没有很强的联系。这些结果支持一种假说即各种生长因子的存在可能是动脉粥样硬化斑块内血管新生的必要条件，但不是充分条件。因此，理论上认为，刺激信号的激活或抑制信号的下调都可以促使斑块内新生血管的发生。

   VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，能促进内皮细胞分裂、增殖、迁移、趋化；能通过促进单核巨噬细胞迁移，进而分泌多种血管生长因子，间接促进血管新生；还能动员骨髓中的内皮细胞祖细胞进入外周循环，并定位到缺血组织，在原位分化形成成熟的内皮细胞，从而形成新的血管。另外，VEGF能刺激内皮细胞合成一氧化氮(NO)并上调一氧化氮合酶(NOS)的表达，进而升高血管通透性，使炎性细胞渗透到组织中，这可能进一步促进血管新生。Matsunaga等在狗模型上应用NOS拮抗剂，七天后发现其缺血区的毛细血管密度明显减少。而且有研究表明，将VEGF基因转染到正常组织中，同样出现血管新生。可见，VEGF在血管新生中升高血管通透性允许炎性细胞浸润、积聚和促进内皮细胞分裂具有同等的重要性。在AS斑块中，平滑肌细胞及巨噬细胞中都有VEGF的强表达，T淋巴细胞、内皮细胞也可生成VEGF。VEGF阳性细胞数目的分布与新生血管的分布高度一致，主要位于斑块肩部与纤维帽部位。几乎所有参与AS发生发展的生长因子和细胞因子都能上调上述细胞表达VEGF。

    FGF是另一类对内皮细胞和平滑肌细胞的生长增殖均有促进作用的多功能生长因子，由内皮细胞、平滑肌细胞、单核巨噬细胞和心肌细胞等合成分泌，目前已发现的FGF有近20种，其中最重要且研究最多的是酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。FGF促进血管新生的作用主要体现在以下几个方面：(1)促进血管内皮细胞的增殖、迁移和形成血管岛；(2)促进具有降解基底膜作用的蛋白激酶的释放；(3)通过PD－ECGF间接地促进平滑肌细胞的增殖。值得注意的是VEGF和bFGF对内皮细胞的增殖、分化及血管新生具有协同效应,而且这种协同效应能增强细胞抗补体介导的血管损伤的保护作用。AS导致的内膜深层缺氧可刺激FGF、VEGF及其受体的表达而促进内皮细胞的生长。

    PD－ECGF是一个45kD非糖基化的单链多肽，斑块肩部的巨噬细胞、星状平滑肌细胞及毛细血管内皮细胞都有PD－ECGF的mRNA表达，PD－ECGF能刺激体外内皮细胞生长、趋化以及体内血管新生。Francesco等证实PD－ECGF通过其受体途径能抑制bFGF的促血管新生作用，可见各种生长因子之间存在相互制约关系。此外，肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子－α(TGF－α)、胎盘生长因子(PlGF)、促血管生成素－1(angiopoietin－1,Ang－1)及制瘤素M(oncostatinM)等均是促血管新生因子。

    3.2 血管新生抑制因子：除刺激血管新生的因素外，体内尚存在抑制血管新生的因素。血小板反应蛋白－1(TSP－1)是主要由血小板分泌的450kD的糖蛋白，也是多种细胞外基质的组成成份，它是体内自然存在的血管新生抑制物。TSP－1在粥样斑块及受损血管处的表达迅速上调，并主要在血管新生的后期开始表达，这可能在基质的稳定以及抑制内皮细胞过度增生及血管新生中起重要作用。Simantov等证实TSP－1抑制血管新生是通过一种组氨酸含量丰富的糖蛋白介导的TSP－1与CD36的交互作用来实现的。目前认为TSP－1是体内高度抑制血管新生的因子，它能阻断生长因子诱导的毛细血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，同时加强PD－ECGF诱导的平滑肌细胞的增殖、迁移。血小板刺激素－1在动脉粥样硬化斑块中普遍存在，它通过p53肿瘤抑制因子起调节作用，而且通过刺激平滑肌细胞增殖抑制斑块内血管新生。促血管生成素－2(angiopoietin－2)对血管的作用具有依赖于VEGF的双重性，在存在VEGF的条件下，可促进血管新生；而缺乏VEGF时，则可导致血管退化。此外，血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、血小板因子－4、α－干扰素等均是血管新生的抑制因子。

    3.3 细胞凋亡:细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性的细胞死亡，它是一个主动的、可控的正常的生命现象，受一系列基因的调控。细胞凋亡可以对抗细胞增殖，过度的细胞凋亡可以限制血管新生并可导致血管退化。生长因子对血管新生具有重要的作用，它们不仅刺激内皮细胞增殖和迁移，同时可抑制内皮细胞凋亡。VEGF和bFGF均可阻止内皮细胞凋亡。Ang－1通过调节内皮细胞和周围基质之间的相互作用，在体内可刺激血管生成并可阻止内皮细胞凋亡。与促血管新生因子相比，血管新生抑制因子至少可部分特异性地诱导内皮细胞凋亡而导致血管退化。

    4.斑块内血管新生的病理生理意义
   
    Moulton等应用血管生成抑制剂endostatin或夫马菌素类似物TNP－470作用于动脉粥样硬化动物模型-载脂蛋白E基因敲除小鼠，经过16周的治疗后，治疗组的斑块面积均比对照组显著缩小，两者对斑块增生的抑制率分别高达85%和70%。这实际上是第一次从治疗的角度直接证实了斑块内血管新生是动脉粥样硬化发生发展的关键因素。2001年Celletti等在胆固醇兔模型上证实VEGF165能增加兔胸主动脉粥样硬化斑块的发生率和程度，进一步证实了血管新生在动脉粥样硬化斑块形成和发展中的作用。斑块内血管新生是促进稳定型斑块向不稳定型斑块发展的重要机制，它的临床重要性在于它与斑块内出血、斑块破裂和不稳定型心绞痛高度相关。

    4.1 斑块内出血：斑块内新生血管作为斑块内出血的一个源泉可能是造成斑块不稳定性的重要原因。斑块内新生血管仅是些简单的内皮细胞围成的管道，周围没有支撑的结缔组织，没有基底膜，由于管壁发育不完善，这些血管脆性大，在局部众多因子的作用下容易破裂出血。斑块内出血使斑块体积迅速增加，而且作为血管生成刺激物使滋养血管继续延伸扩大，进一步增加斑块内出血的机会；并能激活斑块肩部的巨噬细胞，促使它们分泌基质金属蛋白酶(MMPs)或胶原酶，消化纤维帽，使有保护作用的纤维帽更加薄弱从而导致斑块出现裂隙、破裂随之血小板黏附、聚集、血栓形成，引起急性冠状动脉综合征。由于斑块内出血随后出现疤痕以及血栓形成，使血管腔面积减少。而且，肥大细胞产物(如5－羟色胺)及血小板产物(如转移生长因子－β)通过刺激血管周围纤维化而介导血管收缩，加之缺乏代偿性扩张导致管腔直径减少，这意味着斑块内出血能促进管腔狭窄，加重心肌缺血。

    4.2 斑块破裂：导致斑块破裂的因素是多方面的，包括内皮功能状态、斑块内脂质含量、局部炎症程度、不规则斑块处的冠脉张力、局部剪切力等。斑块内新生血管提供了炎性细胞进入斑块的通道，而炎性细胞及其炎性产物对粥样斑块脂质中心的扩大、纤维组织完整性的破坏及细胞外基质的降解均有深刻影响，这可能是造成斑块不稳定、斑块破裂的促发因素。平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡与巨噬细胞、T淋巴细胞释放的细胞因子有关。体外实验证明γ－干扰素(INF－γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素－1(IL－1)可以有效的促进巨噬细胞、平滑肌细胞的凋亡，使脂质中心扩大及纤维帽变薄，斑块易于破裂。斑块肩部富含巨噬细胞，通过吞噬作用或分泌蛋白水解酶,使对斑块稳定起决定性作用的纤维帽变得极薄弱。斑块内激活的单核细胞和巨噬细胞可释放细胞因子如IL－1、TNF－α及其它化学趋化因子导致更多的炎性细胞聚集于病灶处，聚集的巨噬细胞、T淋巴细胞、平滑肌细胞均能释放MMPs降解斑块中的细胞外基质，从而大幅度的削弱纤维帽的稳定性并促进斑块破裂。而细胞因子IL－1、TNF－α及氧自由基均能促进这些酶的表达并能使它们激活。对动脉粥样硬化斑块中MMPs活性的分析表明在这些易损的区域中MMP－2和MMP－9活性增强。2002年Wilson等在猪动脉粥样硬化模型上证实，他汀类药物可减少实验性高脂血症动脉的滋养血管的新生，并可减少VEGF表达和MMP－2及MMP－9的分泌，使斑块更趋于稳定。可见，斑块内新生血管通过炎性细胞的聚集能间接促进斑块破裂。

    4.3 不稳定型心绞痛：Tenaglia等研究了不稳定型心绞痛与斑块中新生血管间的关系。结果表明，在18例有不稳定型心绞痛的标本中，9例  (50%)有大量新生血管形成；而在10例稳定型心绞痛标本中，仅有1例(10%)有新生血管形成。他们提出了新生血管在不稳定型心绞痛中起作用的几个可能机制：一是斑块血管发生区域有大量的细胞增殖，这包括巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞，而我们已知细胞增殖在AS的发病机制中有着重要的意义；二是新生血管由于管壁发育不完善而易破碎，导致斑块内出血、斑块破裂和血栓形成；三是在不稳定型心绞痛病变斑块中大量新生血管发生，新生血管内皮细胞上黏附分子(如VCAM－1、ICAM－1、E－选择素等)表达增加，导致病变中炎性细胞的浸润增加。这些细胞释放蛋白酶使纤维帽变薄，导致了斑块破裂和不稳定型心绞痛的发生。还有另一种新生血管参与不稳定型心绞痛发生的可能机制：在斑块部位的平滑肌细胞，由于钙化与纤维帽的阻隔，因而与大血管腔中的缩血管物质是不能接触的，新生血管在斑块中的存在则为缩血管物质与平滑肌细胞的接触提供了通道，而在新生血管区较其它区域也确实有较高浓度的缩血管物质存在，这将导致局部的血管痉挛和不稳定型心绞痛的发生。

    总之，斑块内血管新生是在AS病变基础上发生的，新生血管又促进粥样硬化病变的发展，在粥样斑块的发生发展中可能是一个核心事件而起着关键性作用。而斑块外的血管新生却有益于心脏、脑、下肢、皮瓣等许多缺血情况的改善，促进侧支循环的建立并可作为加速伤口愈合的一种新策略。因此，Isner等提出了治疗性血管新生的概念，应用生长因子直接注射或其基因转染促使心肌侧支循环建立和小血管生长即治疗性血管新生已成为冠心病治疗学的又一研究热点。但由于本文只限于阐述斑块内血管新生，所以在此不予详述。当然，斑块内血管新生在动脉粥样硬化发生发展中的作用机制仍未彻底阐明，寻求较佳的防治方法仍是目前研究的焦点。对血管新生进行调节也许能为我们认识AS的发病机制和防治AS带来深刻的变革。