| 凝血酶受体检测方法的建立 |
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| 作者：佚名 文章来源：中华医学检验杂志 点击数： 更新时间：2007-9-17 |
凝血酶受体(TR)是G-蛋白偶连受体家族中的一个重要成员，在血小板、血管内皮细胞等有广泛的表达。TR被凝血酶(Ⅱa)激活引起机体凝血反应是引发以动脉粥样硬化为病理基础的人类心脑血管疾病的重要原因。在TR被Ⅱa激活时，TR氨基末端精氨酸41/丝氨酸42间裂解，释放出一含有41个氨基酸的多肽。利用此多肽，我们制备了其单克隆抗体，建立了一种检测TR的免疫酶组织化学法。
一、材料与方法
1.TR1-41多肽：分子量5 000，在美国麻省大学医学院心血管生物学实验室合成。
2.TR1-41单克隆抗体：利用TR1-41免疫小鼠。获得4株分泌RT1-41-McAB的细胞株。
3.免疫组化试剂盒：购自北京中山生物技术有限公司。
4.组织标本：取4例尸检病人心肌和主动脉组织。
5.实验方法：利用免疫组化间接法和丝氨酸磷脂(SP)法对上述切片进行TR检测。为了实验结果的准确可靠，我们在实验中设计了严格的对照。有实验组、一抗对照、二抗对照、DAB对照和抗HBsAg抗体对照，另外，SP法还设有复合物对照。
间接法：(1)切片脱蜡至水，(2)微波修复，(3)H2O2抑制，(4)羊血清封闭，(5)一抗作用，(6)加Fab2-辣根过氧化物酶(HRP)反应，(7)重氮氨基苯(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明封片。
SP法：二抗为生物素标记，作用后和辣根酶标记的链霉卵白素反应，其余同间接法。
二、结果与讨论
采用的两种方法均可检测TR。相比之下，SP法结果染色较深，敏感性比间接法高，但在心肌组织中，背景不清。在2号个体心肌的一抗对照组中，有轻微的非特异性显色；利用美国Jackson免疫研究室提供的Fab2-HRP，采用间接法进行TR检测，阳性结果反应清晰，背景没有非特异染色。原因可能是由于切除Fc端的Fab2标记HRP，能有效防止其和组织细胞上的Fc受体发生非特异结合，更能保证实验结果的准确可靠。在我们检测的4个个体的心肌和血管组织中，两种检测方法的实验组均为TR阳性。4组对照除2号个体的抗HBsAg抗体对照外，其余为阴性。在2号个体的抗HBsAg抗体对照中，两种方法的心肌切片均有阳性显色，SP法稍强，血管组织在SP法也有轻度的显色，与心肌相比，显色较浅。2号个体抗HBsAg抗体对照的这一阳性染色可能与此个体的肝炎病史有关；由于TR和动脉粥样硬化有密切的关系，已有人将TR拮抗剂用于动脉粥样硬化等疾病的治疗。检测外周血细胞的TR含量或血清中TR1-41水平的变化对这些疾病的预防和治疗效果的评价将起到非常重要的作用，我们的工作已为此打下了好的基础。
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