摘要：
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理基础，其发生的危险因素主要为高脂血症、高血压、吸烟等，导致血管壁形成大小不一的斑块，妨碍相应组织器官的血流供应。AS的发病机制尚不明确，R.Ross提出了著名的炎症损伤反应学说，认为AS的发病过程是一种慢性的炎症反应。 巨噬源性泡沫细胞是AS斑块内出现的特征性炎症病理细胞。AS早期单核细胞首先粘附于血管内皮，然后迁移至内皮下分化为巨噬细胞，后者主要通过清道夫受体无节制地吞噬大量ox-LDL，形成泡沫细胞。巨噬细胞是人类机体免疫防御系统不可缺少的一类抗原呈递细胞，然而，近期的研究表明，巨噬细胞的生物学活性促使其在AS的发生和发展中形成巨噬源性泡沫细胞，并在AS炎症反应中发挥重要的作用。研究表明，巨噬源性泡沫细胞不仅本身构成AS斑块的细胞学特征，而且还表达大量的粘附分子和生长因子，参与了AS的发生和发展过程。本实验应用体外建立的巨噬源性泡沫细胞模型，研究VEGF(vascular endothelial growth factor)和ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表达特征，并通过蛋白质组学技术，得到了泡沫细胞形成中蛋白组的差异表达谱，找到了一些新的AS炎症反应功能基因。进一步观察丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)和银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract ,GbE)防治AS的抗炎作用机制，以及对泡沫细胞中ICAM-1及VEGF的调控作用并进行了相关药物蛋白质组学研究。 由于AS的发病机制尚不明确，成功建立AS的病理模型，并在此基础上进行病理机制和药理学研究显得尤为重要。目前最为常用的仍为食饵性AS模型。大鼠具有饲养方便、抵抗力强、食性与人相近等优点，形成的AS病变与人类相似，是较为理想的AS动物模型；但其主要缺点是大鼠的抗病能力强，发病周期过长。本研究采用大剂量VD一次性腹腔注射后与喂食高脂饲料(high fat food, HFD)相结合，成功建立快速诱发大鼠AS模型的方法。本实验在新建的AS大鼠模型基础上，进一步观测VEGF及ICAM-1的表达时程，从体内AS的病理过程中观察炎症相关基因的表达；运用蛋白质组学技术，研究了AS大鼠血清和冠状动脉病变组织的蛋白组差异表达谱。研究中进一步测定了Sal B与GbE对大鼠AS的防治作用和抗炎机制，以及Sal B防治AS的药物蛋白质组。 越来越多的蛋白质组学研究集中于深入研究药物的作用机制，以期发现新的药物作用 靶点和作用途径。本研究在体外、体内AS模型的基础上，采用蛋白质组学技术研究了AS炎症反应过程中蛋白谱的差异表达，并进一步通过药物作用前后蛋白质组的差异，可得到药效相关蛋白质组，发现一些新的药效功能蛋白。 本课题的研究进展主要概括为以下四个方面；1、巨噬源性泡沫细胞中ICAM-1及VEGF的表达及药物的调控作用 (1)采用人类单核细胞系U937细胞与ox-LDL孵育，制作巨噬源性泡沫细胞模型。收集的U937泡沫细胞采用油红O染色后，光镜下观察，胞浆内出现的明显红染脂质颗粒，胞浆内堆积大量红染脂质颗粒，细胞形态呈泡沫状，符合泡沫细胞形态特征。 (2)ICAM-1及VEGF的表达鉴定:采用免疫组化、流式细胞仪、ELISA、Northern Blot技术检测到泡沫细胞形成过程中ICAM-1及VEGF的表达上调；VEGF反义寡核苷酸能够剂量依赖性的抑制泡沫细胞中VEGF的表达。 (3)表达动力学研究表明，ICAM-1与VEGF在泡沫细胞形成的不同阶段表达上调：ICAM-1主要在泡沫细胞形成初期表达上调，而VEGF表达滞后于ICAM-1；小剂量的ox-LDL主要上调ICAM-1的表达，而高剂量ox-LDL主要上调VEGF的表达。 (4)药物Sal B和GbE对于ICAM-1及VEGF的表达均存在显著的抑制作用。当ICAM-1表达在12 h处达到高峰时，Sal B和GbE能剂量依赖性的抑制ICAM-1蛋白及mRNA表达水平；当VEGF表达在48 h处达到最大值时，Sal B和GbE能剂量依赖性的抑制VEGF蛋白及mRNA表达水平。 2、动脉粥样硬化大鼠中ICAM-1及VEGF的表达及药物的调控作用 (1)通过腹腔注射维生素D3与喂食本组自制高脂饲料相结合，建立AS大鼠模型。模型组大鼠4周后主动脉出现AS斑块，6周后冠状血管出现AS病变,同时心肌、肝脏出现脂肪蓄积。 (2)原位杂交结果显示，制作的AS大鼠主动脉和冠状动脉斑块中存在VEGF与ICAM-1 mRNA的高表达；而正常血管组织中未能检测到VEGF与ICAM-1mRNA的阳性表达。 (3)采用Northern Blot方法对VEGF与ICAM-1 mRNA表达进行定量。结果显示模型组大鼠高脂饮食2周后主动脉中ICAM-1表达显著上调，VEGF表达滞后于ICAM-1，6周后显著上调；冠状动脉中ICAM-1与VEGF表达均在4周后开始显著上调。 (4)病理结果显示，药物Sal B和GbE均能够显著降低主动脉和冠状动脉的AS病变程度。Northern Blot结果显示，Sal B和GbE对AS的防治作用与其对ICAM-1与VEGF的抑制作用有关。 3、巨噬源性泡沫细胞模型中蛋白谱的差异表达及药物的作用。首次建立了AS相关的泡沫细胞形成过程中的蛋白差异表达谱。研究发现，巨噬细胞泡沫化过程中37个蛋白点表达发生显著性变化。在互联网上Expansy等已建立的巨噬细胞蛋白质谱数据库的基础上，我们进一步对未知的20余个蛋白点进行了功能蛋白的质谱鉴定，为新型疾病标志性蛋白及新药物靶点的发现打下基础。 |
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