［摘 要］ 目的：在家兔动脉粥样硬化(AS)模型上观察肝、主动脉组织及血浆金属硫蛋白(MT)含量变化，认识AS时机体氧化防御系统的改变。方法：家兔高脂饮食8周，复制高脂血症-动脉粥样硬化模型，分别以［109Cd］血红蛋白饱和法和硫代巴比妥酸法测定家兔肝、主动脉组织及血浆MT及丙二醛(MDA)含量。结果：AS家兔肝组织和血浆MT水平分别较对照组高318%(P＜0.01)和62%(P＜0.01)，而主动脉组织MT含量较对照组低33%(P＜0.01)。肝、主动脉组织及血浆MDA含量分别较对照组高95%(P＜0.01)，76%(P＜0.05)和42%(P＜0.01)，肝组织，血浆MT变化与MDA变化相关。结论：AS家兔肝组织和血浆MT产生增多与脂质过氧化损伤有关。
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发病机制迄今尚未完全阐明，大量实验和临床证据表明氧化应激参与了AS发病过程，尤其是氧化修饰低密度脂蛋白是AS发生的重要危险因素［1］。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是体内富含-SH基的可诱导应激蛋白，具有清除自由基，抗脂质过氧化作用［2］，是机体重要的抗氧化防御体系之一。本实验在家兔AS模型上观察肝、主动脉组织及血浆MT含量变化，以认识AS时机体氧化防御系统的变化。
材 料 和 方 法
一、家兔AS模型复制［3］
日本大耳白兔(本校实验动物中心提供)雌雄各半，体重2.5～3.0 kg，随机分为两组。(1)对照组(n=6)：普通全价营养饲料(粗蛋白20%，粗脂肪13%，碳水化合物60%，灰分1%，维生素混合物1%)连续喂养8周；(2)高脂组(n=6)：在普通全价营养饲料基础上添加10%胆固醇和20%猪油乳剂连续喂养8周。全部动物于实验前及第8周末分别耳缘静脉采血，分离血浆，实验结束时腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后处死，立即取肝脏和主动脉全长(自升主动脉至髂动脉分叉处)用以实验。
二、血脂与脂蛋白(a)含量测定
血清甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白(HDL-C)测定参考杨永宗［4］等的方法，按试剂盒说明书进行。脂蛋白(a)［LP(a)］按Boeheringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。
三、主动脉粥样硬化斑块面积(%)测算
摘取家兔主动脉迅速放入4℃生理盐水中，去掉血管外壁脂肪组织和结缔组织，沿纵向剖开血管壁并平铺于玻璃板上，暴露血管壁内侧，血管动脉粥样硬化处呈明显的白色粥样斑块。黑白照相，以方格计算法计算主动脉粥样斑块占该主动脉总面积的百分比(%)。
四、肝、主动脉组织及血浆MT含量测定［5］
肝和主动脉组织于10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液中制备匀浆、离心，取上清，100℃煮沸5 min。离心、去除沉淀。取上清或血浆200 μL，加入200 μL，［109Cd］液(含Cd2＋2.0 μg/mL，［109Cd2＋］ 37 kBq/mL)混匀，37℃温育10 min。加入100 μL 2%牛血红蛋白，混匀，100℃煮沸2 min，冷却，离心沉淀。反复用牛血红蛋白沉淀操作3次。取上清液200 μL于γ-计数仪上测定［109Cd］放射强度，并换算出MT含量(pmol/mg组织，pmol/mL血浆)。
五、肝、主动脉组织及血浆丙二醛含量测定［6］
肝和主动脉组织于冷生理盐水中制备匀浆，4层纱布过滤后，取组织匀浆液或血浆0.5 mL加入硫代巴比妥酸钠(TBA)溶液5.5 mL，混匀95℃水浴30 min。冷却，离心弃沉淀，于波长532 nm处读OD值，以1.1.3.3-四乙氧基丙烷(TEB)为标准，计算MDA含量(nmol/mg组织，nmol/mL血浆)。
六、统计处理
实验数据以 ±s表示，用组间t检验判断均数差异显著性。
结 果
一、家兔血脂变化及动脉粥样斑块形成
实验前对照组与高脂组家兔血浆TG，TC，HDL-C及LP(a)水平相近，差异无显著(P＞0.05)。高脂饲养8周，家兔血浆TG，TC和LP(a)水平分别高于对照组1.4倍(P＜0.01)，7.4倍(P＜0.01)，14.7倍(P＜0.01)，血浆HDL-C低于对照组50%(P＜0.01)。结果见表1。
表1 家兔血脂及脂蛋白含量( ±s，n=6)
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TG(mmol/L) |
TC(mmol/L) |
HDL-C(mmol/L) |
LP(a)(mg/L) |
| 对照组 |
1.0±0.3 |
3.4±1.5 |
0.8±0.2 |
40.7±29.1 |
| 实验前 |
1.2±0.4 |
2.9±0.9 |
0.9±0.1 |
58.8±14.2 |
| 高脂血症 |
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| 实验后 |
2.4±0.7 |
28.6±9.6 |
0.4±0.1 |
642.4±50.4 |
| 高脂血症 |
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P＜0.01，vs 对照组
对照组家兔无动脉粥样斑块存在，高脂饮食8周后，主动脉可见散在的白色斑块，以主动脉弓和髂动脉分叉处最明显，动脉粥样斑块的总面积占整条动脉面积之比为11.1%±1.6%。
二、家兔肝、主动脉组织及血浆金属硫蛋白含量变化
动脉粥样硬化家兔肝组织及血浆MT含量分别高于对照组318%(P＜0.01)，62%(P＜0.01)，而动脉组织MT含量低于对照组33%(P＜0.01)，结果见图1所示。
图1 肝、主动脉组织及血浆MT和MDA的含量( ±s，n=6)
P＜0.05，P＜0.01，vs 对照组
三、家兔肝、主动脉组织及血浆MDA含量变化
动脉粥样硬化家兔肝、主动脉组织和血浆MDA含量分别高于对照组95%(P＜0.01)，76%(P＜0.05)和42.4%(P＜0.01)，结果见图1。
四、家兔肝组织及血浆MT与MDA含量呈显著正相关
对照组与高脂组肝组织及血浆MT含量与MDA含量呈显著正相关，在肝组织r=0.93(P＜0.01)，血浆r=0.81(P＜0.01)。
讨 论
AS的发生与多种因素有关，但氧化应激和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)的形成是其重要原因［1］。金属硫蛋白(MT)是一类富含疏基及金属的非酶类蛋白，除具有重金属解毒及调节金属代谢平衡外，还具有强大的清除自由基、抑制脂质过氧化作用［2］，是机体重要的内源性应激保护蛋白和抗氧化物质。
本实验观察到高脂饲喂家兔8周，血浆TG、TC、LP(a)含量显著增高，而清除、转运胆固醇，抗AS形成的HDL-C明显下降，主动脉硬化斑块面积达11.1%，表明家兔高脂饮食促发了AS形成。AS家兔肝组织、血浆MT含量显著高于对照，并且与脂质过氧化产物MDA含量变化相关。值得注意的是，AS肝组织、血浆MT含量增高的同时，主动脉组织MT含量反而下降，这可能是动脉粥样斑块的形成损伤了主动脉组织合成MT的能力。
关于AS家兔肝、主动脉组织及血浆MT变化的机制尚不完全清楚。MT为一可诱导应激蛋白，重金属、激素、细胞因子及氧化应激等都可诱导MT高表达，MT可为多种组织细胞诱导合成，其中肝脏是产生MT的主要部位。心肌缺血、缺血-再灌注损伤等病理情况下肝脏MT含量显著增高，并与氧自由基的产生有关［7］。高脂血症家兔血浆内存在有OX-LDL及OX-VLDL，AS病灶中亦存在OX-LDL［8］。氧自由基、OX-VLDL均可损伤内皮细胞，促细胞因子(IL-1)和生长因子释放，而诱导MT产生。本实验中AS家兔肝组织、血浆MT含量显著增高，并且与脂质过氧化产物MDA含量变化相关，提示MT产生增多与AS家兔自由基、OX-LDL等引起的过氧化损伤有关。
MT作为机体的内源性应激蛋白，可在多种因素诱导下大量产生，通过其清除自由基、抑制脂质过氧化等作用而增强机体的抗损伤反应。已有大量实验证明，MT在缺血、缺氧、缺血-再灌注损伤等病理过程中的高表达都具有细胞保护作用。本实验观察到的动脉粥样硬化家兔体内MT含量增高可能也是机体的一种代偿适应性保护反应。外源性给予或内源性诱导MT产生可能是防治AS发生发展的措施之一。
［参 考 文 献］
［1］ Liu SX, Zhou M, Chen Y, et al. Lipoperoxidative injury to macrophages by oxidatively modified lipoprotein may play an important role in foam cell formation［J］. Atherosclerosis, 1996, 121:55～61.
［2］ Masao Sato, Lan Bremner. Oxygen free radicals and metallothionein［J］. Free Radical Biol Med, 1993,14:325～330.
［3］ Hasenfuss G. Animal models for cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy［J］. Cardiovasc Res, 1998, 39:60～76.
［4］ 杨永宗，陈颜芳，刘易林，等.L-精氨酸对高脂血症家兔血浆脂蛋白，一氧化氮和脂过氧化的影响.中国动脉粥样硬化杂志，1997，5(3)：206～208.
［5］ David LE, Brian FT. Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assays for the rapid determination of metallothionein in biological tissues［J］. Toxical Appl Pharmacol, 1982, 66:134～142.
［6］ Asakawa T, Marashuhushita S. Thiobarbituric acid test for detecting lipid peroxides［J］. Lipids, 1979,14:401～406.
［7］ 唐朝枢，王培京，李 江，等.心肌梗塞大鼠组织金属硫蛋白含量变化［J］.中华心血管病杂志，1989，17(5)：283～284.
［8］ 江 渝 ，刘秉文，范 平，等.内源性高甘油三酯患者体内存在氧化型LDL-VLDL及HDL［J］.中国动脉硬化杂志，1997，5(2)：99～101
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