[摘要]
目的：探讨氧化应激对动脉粥样硬化(AS)早期血管舒缩功能的影响。
方法：高胆固醇饮食建立兔AS模型。生化法检测全血超氧化物歧化酶(SOD) 、主动脉壁一氧化氮合酶(NOS)活力及血清丙二醛(MDA) 、脂质和主动脉壁一氧化氮(NO)水平，并进行病理形态学观察。
结果：模型组血清总胆固醇(TC) 、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 、甘油三酯(TG)水平及主动脉壁NOS活力、NO含量均显著高于同期对照组(P<0.01) , 其中NOS活力及NO含量于16周达峰值，24周呈现下降趋势；模型组全血SOD活力及MDA含量于实验8周出现显著变化,随着TC、LDL-C水平的升高，SOD活力进行性下降，而MDA含量持续升高，各阶段均有显著差异(P<0.05) 。
结论：氧化应激导致内皮功能紊乱、NO失活，可能是AS早期血管舒缩功能障碍的重要机制之一。
活性氧过量生成，超出机体的抗氧化能力，就会对机体造成氧化损伤，即氧化应激。氧化应激参与并促进动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生、发展,但确切机制仍不清楚。作者观察全血超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)活力、血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、主动脉壁一氧化氮合酶( nitric oxide synthase, NOS)活力及一氧化氮( nitric oxide, NO)含量在AS早期的变化，探讨氧化应激对AS早期血管舒缩功能的影响，为早期防治AS提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 兔AS模型的建立及取材
健康雄性纯种新西兰白兔36只，由中国医科大学实验动物中心提供，体重(2.35±0.33) kg，3个月龄。随机分为：对照组15 只，喂饲基础颗粒饲料120～150 g/d。模型组21只，喂饲基础颗粒饲料+2%猪油+ 1%胆固醇[1]，120～150 g/d。分别于实验8，16，24周从对照组抽取5只、模型组抽取7只兔采血、取材。血标本均在禁食12 h后经耳中央动脉或心腔直接抽取。10%水合氯醛腹腔麻醉下，留取主动脉标本，主动脉弓置10% 钙-甲醛中固定行病理检测，余段立即置入液氮中保存、待用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 血清总胆固醇( total cholesterol, TC)，甘油三酯( triglyceride, TG)，高密度脂蛋白胆固醇( high-density lipop rotein cholesterol, HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇( low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)测定：采血后立即分离血清，采用酶比色法，用日立7150型全自动生化分析仪进行检测。
1. 2. 2 全血SOD活力测定：羟胺法检测。每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位。
1. 2. 3 血清MDA测定：采用硫代巴比妥酸法检测。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按说明书操作。
1. 2. 4 主动脉NOS活力测定：试剂盒购自南京建成生物工程研究所。低温下制备10%胸主动脉匀浆，离心，取上清，按试剂盒说明书操作、检测。双缩脲法测定蛋白含量。
1. 2. 5 主动脉NO含量测定：采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。取制备的10%胸主动脉匀浆，用硝酸还原酶法测定血管壁(NO3- +NO2-)含量准确代表NO水平。
1. 2. 6 病理检查：取已用钙-甲醛固定24 h以上的主动脉弓，常规石蜡包埋、切片，HE染色镜检。观察各组主动脉的病理变化。
1. 3 统计学处理
采用SPSS 11. 5统计软件分析数据。全部数据以x ±s表示，用one-way ANOVA进行统计学处理，组间比较应用Student-Newman-Keuls法检验， P <0. 05为有显著性差异。
2 结果
2. 1 血脂水平测定结果(表1)
模型组血清TC、LDL-C、TG及动脉粥样硬化指数(TC/HDL-C)均明显高于对照组(P< 0.01)，而且随饲养时间的延长，模型组TC、LDL-C显著升高(P<0.01) 。
2. 2 主动脉壁NOS活力、NO含量、全血SOD活力及血清MDA含量的变化(表2)
模型组主动脉NOS活力、NO含量显著高于对照组(P<0.01)，并于16周达峰值，而24周NOS活力、NO含量则呈下降趋势；模型组SOD 活力逐渐下降(P<0.05)；而MDA 含量则逐渐升高(P<0.05)，这些变化于实验8周时就已经出现。
表1 各组血脂的变化( x ±s，mmol/L)
|
组 别 |
n |
TC |
TG |
HDL-C |
LDL-C |
TC/HDL-C |
|
8周 对照组 |
5 |
1. 10 ±0. 21 |
0. 56 ±0. 12 |
0. 55 ±0. 13 |
0. 57 ±0. 12 |
1. 99 ±0. 49 |
|
模型组 |
7 |
15. 15 ±3. 581) |
1. 00 ±0. 291) |
0. 80 ±0. 18 |
7. 26 ±0. 551) |
19. 25 ±3. 831) |
|
16周 对照组 |
5 |
1. 00 ±0. 16 |
0. 53 ±0. 10 |
0. 56 ±0. 06 |
0. 47 ±0. 06 |
1. 84 ±0. 21 |
|
模型组 |
7 |
25. 39 ±4. 621, 2) |
1. 25 ±0. 271) |
0. 92 ±0. 21 |
9. 84 ±1. 341, 2) |
28. 34 ±6. 371) |
|
24周 对照组 |
5 |
1. 00 ±0. 12 |
0. 58 ±0. 12 |
0. 61 ±0. 11 |
0. 53 ±0. 08 |
1. 72 ±0. 41 |
|
模型组 |
7 |
37. 35 ±5. 881, 2) |
3. 07 ±0. 791, 2) |
0. 74 ±0. 31 |
15. 09 ±3. 301, 2) |
16. 63 ±1. 871) |
注：1)与对照组比较P < 0. 01；2) 与前期比较P < 0. 01
表2 主动脉NOS活力、NO含量、全血SOD活力及血清MDA含量变化(x ±s)
|
组 别 |
n |
NOS( nmol·g- 1 ·min - 1 ) |
NO(μmol/ g) |
MDA( nmol/L) |
SOD(NU /μl) |
|
8周 对照组 |
5 |
133. 02 ±20. 06 |
2. 45 ±0. 27 |
5. 51 ±0. 14 |
3. 41 ±0. 20 |
|
模型组 |
7 |
285. 84 ±25. 271) |
4. 59 ±0. 461) |
10. 63 ±0. 421) |
2. 91 ±0. 261) |
|
16周 对照组 |
5 |
141. 74 ±18. 15 |
2. 50 ±0. 28 |
5. 52 ±0. 13 |
3. 46 ±0. 21 |
|
模型组 |
7 |
326. 62 ±24. 401, 2) |
5. 27 ±0. 651, 2) |
14. 51 ±0. 631, 2) |
2. 44 ±0. 301, 2) |
|
24周 对照组 |
5 |
135. 65 ±17. 39 |
2. 44 ±0. 45 |
5. 54 ±0. 16 |
3. 44 ±0. 23 |
|
模型组 |
7 |
309. 22 ±17. 411) |
5. 08 ±0. 591) |
18. 31 ±0. 641, 2) |
2. 14 ±0. 131, 2) |
注：1)与对照组比较P < 0. 01； 2) 与前期比较P < 0. 05
2. 3 形态学观察结果
对照组：主动脉内膜平坦，中膜平滑肌细胞排列规整，实验各阶段未见明显病理变化。模型组：实验8周，主动脉内膜下脂质沉积，有较丰富的泡沫细胞浸润，脂纹期改变；16周，主动脉内膜病变处可见限局性增厚的斑块及表层的胶原纤维，其下有不等量增生的平滑肌细胞、巨噬细胞及泡沫细胞。中膜平滑肌细胞排列不规则，有向内膜迁移的趋势，呈纤维斑块期改变；24周，可见粥瘤形成，斑块深层无定形的坏死崩解物质，内有形如针状空隙的胆固醇结晶，呈粥样斑块期改变。
3 讨论
AS是多种危险因素引发的一种慢性、进行性的疾病过程。在众多的致病危险因素中，高胆固醇血症造成动脉内皮功能损害尤为关键，氧化应激则被认为在这一损伤过程中发挥重要作用。NO是重要信使分子，具有舒张血管、抑制细胞黏附、血小板聚集和抑制平滑肌细胞增殖等生理功能，是反映血管舒缩功能的重要物质[2]。NOS是催化NO合成的关键酶。观察NO及其合酶的变化，探讨NO系统变化机制，对于揭示AS早期血管舒缩功能障碍机制和AS发生、发展机制具有重要意义。
本研究发现，伴随着胆固醇水平的升高，模型组全血SOD活力进行性下降，血清MDA含量进行性升高，并于实验8周时就已出现明显改变。表明高胆固醇血症损伤动脉壁的抗氧化机能，氧自由基等活性氧大量生成，且清除障碍[3] ，脂质过氧化物分解代谢产物MDA含量增加，加重局部的损伤[4]。
模型组NOS活力增高，推测病程中某些因素促进NOS表达和蛋白质合成。已有研究表明剪切应力、肿瘤坏死因子、氧化型低密度脂蛋白等增强和诱导NOS(包括eNOS、iNOS)表达[5～7]，这些研究支持本实验结果。高脂饮食，应激性地引起NOS表达增强，以合成更多的NO抵抗这种损伤。而24周NOS活力呈下降趋势，考虑与细胞崩解、坏死，酶表达下降有关，但与16周相比，两组结果未见显著差异，可能与实验动物数量有关。
NO含量与NOS活力变化相对应。模型组NO含量升高，并于16周达峰值，这与LING[8]等的实验结果相似，揭示短期和长期胆固醇喂养并未使NO合成减少。对于存在的血管舒缩功能障碍，分析认为：胆固醇过量摄入抑制了NO向亚硝酰基化合物(可能是更强、更稳定的内皮细胞衍生舒张因子)的转化[9] 。喂饲胆固醇引起内皮细胞巯基团氧化成二硫化物，使内皮细胞衍生舒张因子合成必需的基质缺乏，导致NO向亚硝酰基化合物的转化受阻，舒血管作用减弱；NO 失活增加。大量产生的氧自由基使NO失活增加，NO与O2- 反应生成强氧化剂超氧亚硝酸根离子(ONOO- ) 等多种毒性代谢产物[10]，推动AS发展。
可见，在AS早期,就已经出现氧化系统的异常，氧化应激导致内皮功能紊乱、NO 失活，可能是血管舒缩功能障碍的重要机制之一，是推动AS发生、发展的重要因素。对氧化应激的深入研究，将为临床更有效的防治AS提供有力的理论依据。
参考文献：
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 氧化应激对动脉粥样硬化兔早期血管舒缩功能影响的研究 |
