【摘要】 目的：探讨雄激素受体（AR）基因CpG岛（CCGG）胞嘧啶甲基化模式与动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）的关系。方法：应用甲基化敏感的限制性内切酶及聚合酶链式反应（PCR）对96例动脉粥样硬化患者、91例正常对照人群AR基因CpG岛甲基化模式进行比较，并进行分析。结果： 男性患者AR基因CpG岛甲基化程度较男性对照组为低（P<0.05）；女性患者AR基因CpG岛甲基化程度较女性对照组差异无显著（P>0.05）；男性患者与女性患者相比较，男性患者AR基因CpG岛甲基化程度较低（P<0.05）；男性对照与女性对照的甲基化模式差异无显著（P>0.05）。结论：AR基因CpG岛存在的低甲基化模式对AS诊断有一定的临床意义。
引言
临床经验证明，男性人群心血管发病率较绝经前同龄阶段女性明显为高，国内外对此进行了研究，发现外源性睾酮可引起脂蛋白代谢异常，促进血小板聚集和血管收缩，这些都是动脉粥样硬化(AS)产生前的变化［1，2］。但是临床研究证实男性冠心病发病与个体间血浆睾酮水平的差异无关［3］，是否由于其受体水平差异？为此，我们在排除了能导致AS发病的其他发病因素前提下，对雄激素受体(AR)基因CpG岛甲基化模式与AS易感性的关系进行研究，以期对性别是AS高发的原因之一做出可能解释，并对预防治疗早期AS提供理论基础。
1对象和方法
1．1对象
AS病例96(男62，女34)例，年龄50～78（64.5±11.2）岁，均经冠脉造影证实有狭窄或粥样斑块。 对照91(男47，女44)例，年龄46～80（68.6±9.5）岁，均经冠状动脉造影或血管多普勒超声查证无狭窄或粥样斑块。所有研究对象均无血缘关系，外周血由唐都医院心脏内科提供。
1．2方法
1．2．1基因组DNA的提取外周血5 mL，加DNA提取液（含10 mol/L Tris Cl pH 8.0，0.1 mol/L EDTA，pH 8.0，5 g/L SDS），蛋白酶K消化。饱和酚／氯仿法抽提DNA，冰乙醇沉淀，TE溶解。紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度。
1．2．2酶切多重PCR所需甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ，MspⅠ购自华美公司。Taq DNA polymerase购自鼎国生物技术公司。多重PCR采用两对引物，分别为AR基因引物5′GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT3′及5′TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC3′和雌激素受体(ER)基因引物，均由上海申友生物技术公司合成。 分三组进行试验：①空白对照；②1 μg DNA加HpaⅡ 40 U和10×Buffer 2 μL，补水至20 μL，充分混匀置37℃过夜；③1 μg DNA加MspⅠ 40 U和10×Buffer 2 μL，补水至20 μL，充分混匀置37℃过夜. 酶切产物加入醋酸钠无水乙醇后在-30℃沉淀2 h，倒液晾干后进行PCR. PCR反应总体积30 μL，内含dNTP 200 mmol/L, 引物各25 pmol/L，3 μL Buffer缓冲液. PCR程序：97℃预变性7 min，94℃ 3 min时加Tap酶4 U，60℃ 60 s, 72℃ 60 s。 进入循环：94℃ 45 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s循环30次，72℃延伸10 min。 扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外透射检测电泳带并照相。
1．2．3甲基化分析原理HpaⅡ，MspⅠ均能识别CCGG序列，但HpaⅡ仅内切未甲基化的CCGG序列，不能内切m5CCGG，m4CCGG，Cm5CGG，Cm4CGG，hm5Chm5CGG序列；MspⅠ除内切CCGG序列外，还可内切Cm5CGG，m4CCGG，Cm4CGG，不可内切m5CCGG，hm5Chm5CGG（m4，m5代表甲基与C连接的位置，若同时存在甲基化则加h表示）。若DNA序列中含有未被内切的位点，则经PCR扩增后有特异性带。
统计学处理：分别计算男性、女性患者AR基因CpG甲基化的百分率，并用χ2检验。
2 结果
检测AS人群与对照人群AR基因CpG岛5CCGG3位点甲基化模式，多重PCR采用两对引物在同一反应体系中反应，保证了分子量较小条带缺失的样本确实是由底物DNA链被切断所致。由于内切酶不能将甲基化的样本切断，故PCR时可以扩出分子量较小的条带；若内切酶可以将样本在充分消化酶切后完全切断，则在PCR时不能扩出分子量较小的条带。另外一对引物在同一条件下扩出分子量较大的条带，证明了样本确系目的片段不完整而未扩出。
男性中，男性患者CpG岛甲基化人数占男性患者总数的17.7％，男性对照CpG岛甲基化人数占男性对照总数的38.3％，二者之间差异显著（χ2=5.78, P<0.05）。女性中，女性患者CpG岛甲基化人数占女性患者总数的47.1％，女性对照CpG岛甲基化人数占女性对照总数的52.3％，二者之间差异无显著（χ2=0.21, P>0.05）。
男性与女性相比较，患者中，男性患者CpG岛甲基化程度（17.7%）与女性患者CpG岛甲基化程度（47.1%）相比甲基化模式存在显著差异（χ2=9.34, P<0.05）；对照组中，男性对照CpG岛甲基化程度（38.3%）与女性对照CpG岛甲基化程度（52.3%）相比则没有显著差异（χ2=1.79, P>0.05）。
3讨论
AR属于配体依赖的转录因子超家族。人AR Mr为98 500，由910个氨基酸组成。整个分子可分为三个功能区：具有转录活性的N端区(nterminal domain, NTD)、与靶基因上雄激素反应元件特异结合的DNA结合域(DNA binding domain, DBD)以及C末端的配体结合域(ligand binding domain, LBD)。AR基因位于Xq1112，总长度大于90 kb，包括8个外显子和7个内含子。起始部第一外显子编码受体N端区，第二、三外显子编码DBD，其余5个外显子编码LBD。
雄性激素具有刺激细胞增值的特性，其功能发挥需与受体结合。AR与雄性激素结合后，通过与核中特定DNA序列雄激素反应成分结合，调节靶基因的表达并发挥其生理作用。Sasaki［4］在研究AR基因表达及CpG岛甲基化时发现：70/89子宫内膜癌组织AR表达阴性，64/89子宫内膜癌组织AR基因CpG岛发生甲基化，推测AR基因失活的机制可能是通过AR基因CpG岛的甲基化来实现的。
DNA甲基化有其重要的生物学意义，它的作用表现在控制基因表达［5］，维护染色体的完整性［6］和调节DNA重组的某些环节［7］， 最近，DNA甲基化又被认为可能在抵御外来入侵的寄生DNA中起重要作用［8］。正常DNA甲基化模式改变，包括DNA过低甲基化和高甲基化，他们在肿瘤的发生中都具有重要的意义［9］，在整个基因组中，CpG岛通常位于基因的启动子区域，在正常情况下，CpG岛是以非甲基化形式存在于基因的启动子内，但有两个例外，一个是在已失活的X染色体上的基因［10］，例如女性的一条X染色体；二是印记基因［11］。 在这两种情况下，其启动子区域的CpG岛是甲基化的，而且这种甲基化是与该基因的转录抑制有关［12-14］。
动物实验中业已证实，动物血管平滑肌的异常甲基化状态能引起动物血管内表面的异常增殖［15-17］。而我们在对AS人群AR基因CpG岛甲基化模式进行检测时，发现男性患者与对照人群的甲基化程度有明显差异（P<0.05），证明男性患者AR基因CpG岛存在的低甲基化模式可能对AS的发病有一定意义。AR基因CpG岛的去甲基化使其转录趋于活跃，体内受体含量增高，雄激素便能促进心血管系统产生类AS样改变。大量的临床经验证明，AS患者中男性患病率要比女性高。本实验中男性患者与女性患者之间AR基因CpG岛的甲基化存在显著差异（P<0.05），而男性对照与女性对照之间则没有显著差异（P>0.05），说明排除能导致AS发病的其他因素外，性别可以作为一个独立的心血管疾病发病危险因子。对于女性来说，由于其一条X染色体为固缩状态，且女性病例均为绝经期后的病例，X染色体大都存在不同程度的固缩，所以女性患者与对照人群之间没有显著差异（P>0.05）。 因此，女性患者与对照人群之间是否存在AR基因CpG岛的去甲基化还有待进一步的研究。
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