[摘　要] 　目的　探讨巨噬细胞炎性蛋白1α在2 型糖尿病患者和非糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布。方法　采用免疫组织化学方法分别检测13 例2 型糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜(5 例脂纹期动脉内膜和8 例纤维斑块期动脉内膜) 、15 例非糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜(6 例脂纹期动脉内膜和9 例纤维斑块期动脉内膜) 及7 例健康人正常动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α的表达和分布，并利用计算机图像分析仪对免疫组织化学染色切片进行灰度扫描，作相对定量分析。结果　正常动脉内膜未见巨噬细胞炎性蛋白1α阳性表达,平均灰度值为234. 27 ±8. 04。巨噬细胞炎性蛋白1α在非糖尿病患者不同期的动脉粥样硬化动脉内膜中呈不同程度的表达，巨噬细胞炎性蛋白1α在脂纹期动脉内膜平均灰度值为168. 40 ±7. 69，主要分布在内皮细胞及泡沫细胞中；巨噬细胞炎性蛋白1α在纤维斑块期动脉内膜平均灰度值为173. 67 ±6. 56，主要分布在泡沫细胞，而内皮细胞仅有弱的巨噬细胞炎性蛋白1α染色。在糖尿病患者脂纹期及纤维斑块期动脉内膜中，内皮细胞及泡沫细胞中皆有较强的巨噬细胞炎性蛋白1α染色，脂纹期动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α平均灰度值为132. 73 ±6. 01，纤维斑块期动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α平均灰度值为138. 68 ±9. 41。结论　正常动脉内膜未见巨噬细胞炎性蛋白1α阳性表达。巨噬细胞炎性蛋白1α在非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达明显增多，在纤维斑块期动脉内膜中的表达逐渐减弱。巨噬细胞炎性蛋白1α在糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达显著增高,与非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05)；在糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中仍有较强的表达，与非糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05)。

    动脉粥样硬化(atherosclerosis ,As) 是一种包括炎性细胞浸润、平滑肌细胞增殖、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理过程的慢性炎症疾病。其中，外周血单核细胞粘附于血管内皮细胞并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是As 形成的重要早期事件¹，在此过程中趋化因子发挥了极其重要的作用。巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α) 属于CC 型趋化因子，是招募单核细胞进入血管壁的重要趋化因子。糖尿病患者由于As 而发生的冠心病、缺血性或出血性脑血管病、肢端坏疽等并发症均明显高于非糖尿病人群，是当今糖尿病患者致死致残的重要原因，确切机制尚不清楚。本研究采用免疫组织化学方法，检测MIP-1α在2 型糖尿病患者和非糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布，探讨MIP-1α在2 型糖尿病患者动脉粥样硬化形成和发展中的作用。

    1 对象与方法

    1.1 材料

    兔抗人MIP-1α 多克隆抗体、免疫组织化学SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒及APES 购自武汉博士德公司。

    1.2 受试者资料

    受试者资料见表1，其中13 例2 型糖尿病患者均符合1999 年WHO 糖尿病诊断标准。

    表1. 受试者一般资料

	糖尿病患者	糖尿病患者	非糖尿病患者	非糖尿病患者	非糖尿病患者
	脂纹期( n = 5)	纤维斑块期( n = 8)	正常动脉( n = 7)	脂纹期( n = 6)	纤维斑块期( n = 9)
男(例)	3	6	4	4	6
女(例)	2	2	3	2	3
年龄(岁)	54 ±12	67 ±13	36 ±16	56 ±11	64 ±9
动脉名称	股动脉( n = 4) 肠系膜上动脉( n = 1)	股动脉( n = 8)	股动脉( n = 4) 肠系膜上动脉( n = 3)	股动脉( n = 3) 肠系膜上动脉( n = 2) 肾动脉( n = 1)	股动脉( n = 6) 腹主动脉( n = 2) 肾动脉( n = 1)
损伤原因	外伤、肿瘤	下肢坏疽	外伤、肿瘤	外伤、肿瘤	外伤、动脉瘤、肿瘤
术式	截肢术	截肢术	截肢术	截肢术	动脉瘤切除术
	肿瘤切除术		肿瘤切除术	肿瘤切除术 肾切除术	截肢术 肾切除术

    1.3 标本的处理

    将术中获得的新鲜标本在离体30 min 内用OCT包埋，放入液氮中迅速冷冻形成冻块，取出后用铝箔包好，编号后存入- 80 ℃冰箱中保存。实验前于恒温冰冻切片机制成6μm 厚的冰冻切片，贴于涂有防脱片剂APES 的载玻片上，4 %多聚甲醛固定20 min，PBS 冲洗，准备用于HE 染色、油红O 染色及免疫组织化学检测。

    1.4 组织学检查

    冰冻切片经HE 染色后在光学显微镜下行病理分期：非糖尿病组正常动脉7 例，脂纹期6 例，纤维斑块期9 例；糖尿病组脂纹期5 例，纤维斑块期8例。

    1.5 油红O 染色

    固定后的冰冻切片用60 %异丙醇浸泡30 s；油红O 稀释液55 ℃浸泡40 min；60 %异丙醇浸泡10 s；苏木素染色2 min；自来水冲洗5 min；甘油明胶封片。

    1.6 免疫组织化学检测

    根据武汉博士德公司提供的技术指导说明进行(SABC 法)。30 %过氧化氢+ 纯甲醇50 份混合，将切片室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗(3 ×5 min) 。滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗。每张切片滴加兔抗人MIP21α多克隆抗体(1∶200) 20 μL，4 ℃过夜。PBS 冲洗(3 ×5 min) 。滴加生物素化山羊抗兔IgG，20 ℃20 min。PBS 冲洗(3 ×5 min) 。滴加SABC，20 ℃ 20 min。PBS 冲洗(5 ×5 min) 。DAB 显色15 ～20min ，苏木素复染，中性树胶封片。用PBS 替代一抗作为阴性对照。

    1.7 统计学处理

    数据以x ±s 表示，采用方差分析。

    2 结果

    2.1 油红O 染色

    健康人正常动脉内膜油红O 染色阴性，非糖尿病患者及糖尿病患者动脉内膜均可见油红O 染色阳性(图1) 。
   
    图1. 动脉粥样硬化动脉内膜油红O 染色( ×400)

    2.2 免疫组织化学检查

    7 例健康人正常动脉内膜未见棕褐色细颗粒状物沉积，即未见到MIP-1α阳性表达(图2) 。非糖尿病患者MIP-1α在脂纹期动脉内膜中的表达明显增多，主要分布在内皮细胞及泡沫细胞中；MIP-1α在纤维斑块期动脉内膜中的表达逐渐减弱，主要分布在泡沫细胞，而内皮细胞仅有弱的MIP-1α染色(图3) 。糖尿病患者脂纹期及纤维斑块期动脉内膜中内皮细胞及泡沫细胞中皆有较强的MIP-1α染色(图4) 。

   
    图2. 正常动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α免疫组织化学染色( ×400)
   
    图3. 非糖尿病动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α免疫组织化学染色( ×400) 　　A 为脂纹期, B 为纤维斑块期。
   
    图4. 糖尿病动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α免疫组织化学染色( ×400) 　　A 为脂纹期, B 为纤维斑块期。

    2.3 巨噬细胞炎性蛋白1α免疫沉积物灰度值分析

    非糖尿病组正常动脉内膜MIP-1α平均灰度值为234.27 ±8.04，脂纹期动脉内膜平均灰度值为168.40±7.69，纤维斑块期动脉内膜平均灰度值为173.67±6.56 。糖尿病组脂纹期动脉内膜平均灰度值为132.73±6.01；纤维斑块期动脉内膜平均灰度值为138.68±9.41 。

    3 讨论

    动脉粥样硬化(As) 病变是由于血管内皮和平滑肌细胞受各种因素损害而产生的过度的炎症性———纤维增殖性反应² 。外周血单核细胞粘附于内皮并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是As 形成的重要早期事件，在此过程中单核细胞受多种趋化因子的招募，其中单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1 , MCP-1) 对单核细胞的趋化作用已被许多研究者所证实^3,4 。文献5 报道，同时敲除MCP21 基因和低密度脂蛋白受体基因的小鼠在喂饲高胆固醇饮食后，其As 病变与单纯敲除低密度脂蛋白受体基因的小鼠相比明显减轻，但动脉的病变并未完全消失，主动脉壁内仍有巨噬细胞浸润，说明在单核细胞迁入内皮下间隙过程中，除MCP-1 外，还有其他趋化因子的参与。MIP-1α 与MCP-1 同属于CC 型趋化因子，其趋化作用的靶细胞是T 淋巴细胞和单核P巨噬细胞，亦参与单核细胞的募集及泡沫细胞的形成^6,7 。已有研究表明，低密度脂蛋白及同型半胱氨酸可以诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达MIP-1α^8,9 。体内实验更明确表明MIP-1α可引起单核细胞及淋巴细胞的浸润，并能活化血管内皮细胞，而且在食饵性动脉粥样硬化斑块中有大量存在MIP-1α，由此可见， MIP-1α在动脉粥样硬化的发生中亦起着重要作用。

    糖尿病是临床上一种常见病和多发病，血管并发症是糖尿病患者的主要致残及致死原因。流行病学调查资料表明，糖尿病患者发生As 及危及生命的心血管并发症的危险性较正常人增加了3～4 倍。Hayes 等¹⁰ 证实在As 病变中表达MIP-1α，那么，MIP-1α在糖尿病患者As 病变中表达与分布如何，尚未见文献报道。本研究结果发现，正常动脉内膜未见MIP-1α阳性表达。MIP-1α在非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达明显增多，在纤维斑块期动脉内膜中的表达逐渐减弱。MIP-1α在糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达显著增高，与非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05)；在糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中仍有较强的表达,与非糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05) 。我们通过免疫组织化学方法观察到，非糖尿病患者早期及晚期As 中表达MIP-1α的细胞类型是不一样的，在早期As 中内皮细胞及泡沫细胞是MIP-1α的主要来源，而晚期As 中泡沫细胞是MIP-1α的主要来源，此结果与其他报道一致¹¹；这可能是由于内皮细胞表达MIP-1α启动单核细胞迁至内皮下间隙。糖尿病患者早期及晚期As 中表达MIP-1α的细胞类型均是内皮细胞及泡沫细胞，说明高血糖是导致内皮细胞产生MIP-1α增加的因素，高糖环境下刺激内皮细胞产生MIP-1α增加是促发As 形成的原因之一，其机制可能与高糖的直接作用或促使蛋白糖基化进而促进内皮细胞产生MIP-1α有关。

[参考文献]

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3 Uguccioni M, D’Apuzzo M, Loetscher M, Dewald B , Baggiolini M. 　Action of the chmotactic cytokinesMCP-1 , MCP-2 , MCP-3 , RANTES , MIP-1αandMIP-1βon human monocytes. Eur J Immunol , 1995 , 25 (1) : 64-68
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5 Gu L , Okada Y, Cliton SK, et al. Absence of monocyte chemoattract protein-1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor deficient mice. Mol Cell , 1998 , 2 : 275-281
6 Gosling J , Slaymaker S , Gu L , Tseng S , Zlot CH , Young SG, et al. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. J Clin Invest , 1999 , 103 (6) : 773-778
7 Lee SC , Brummet ME , Shahabuddin S , Woodworth TG, Georas SN , Leiferman KM, et al. Cutaneous injection of human subjects with macrophage inflammatory protein -1αinduces significant recruitment of neutrophils and monocytes. J Immunol , 2000 , 164 (6) : 3 392-402
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9 王淑秀, 邓仲端, 倪娟, 瞿智玲. 同型半胱氨酸诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α. 中国动脉硬化杂志, 2002 , 10(2) : 101-104
10 Hayes IM, Nicola JJ , Sewah T, Smith G, Paterson JR , Earnshaw JJ , et al. Human vascular smooth muscle cells express receptors for cc chemokines. Arterioscler Thromb Vas Biol , 1998 , 18 (3) : 3972403
11 Takeya M, Yoshimura T, Leonard EJ , Takahashi K. Detection of monocyte chemoattractant protein21 in human atherosclerotic lesions by an anti-monocyte chemoattractant protein21 monoclonal antibody. 　Hum Pathol , 1993 , 24 (5) :534-539

    2 型糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜巨噬细胞炎性蛋白1α的改变