【摘要】

    目的 研究融合蛋白CTLA4Ig 对氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的T 淋巴细胞特异性免疫反应的作用，探索预防和延缓动脉粥样硬化发生和发展的新途径。

    方法 从健康成人外周血分离单核细胞，加入500 IU/ml 的重组人粒单细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和500 IU/ml的重组人白细胞介素4（rhIL-4），培养6 d。取 1×106 个细胞以流式细胞仪检测CD14 的表达，其余细胞分为4 组，分别加入细菌脂多糖（LPS）30 ng/ml（LPS 组）、LDL 10 μg/ml（LDL 组）、ox-LDL 10 μg/ml（ox-LDL 组）和相同体积的PBS（PBS 组），作用48 h，以流式细胞仪检测CD86 和HLA-DR 的阳性表达率和平均荧光强度（MFI）。将各组DC与同种异体T 淋巴细胞以1:5 和1:10 的比例混合进行同种异体混合淋巴细胞增殖反应（MLR），其中ox-LDL 组在1:5的试验中分为4 个亚组，分别给予加入1.25、0.62、0.31 μg/ml的CTLA4Ig 和不加CTLA4Ig 的处理，各组细胞继续培养4 d，以噻唑蓝（MTT）比色法检测T 淋巴细胞增殖活性，结果以刺激指数（SI）表示。

    结果 细胞培养6 d 后CD14 的阳性表达率为2.9%，证实已由单核细胞转化为DC。LPS 组、ox-LDL 组CD86 阳性表达率（96.0%±8.8%，97.7%±11.4%）和HLA-DR 阳性表达率（ 90.3%±8.8% ， 90.9%±7.0% ） 均明显高于LDL 组（90.0%±10.2%，84.4%±9.6%）和PBS 组（87.3%±8.4%，83.6%±7.0%）（均P<0.05），ox-LDL 组CD86 MFI（73.4±6.6）和HLA-DR MFI（87.0±7.1）均明显高于LDL 组（40.0±7.4，55.0±7.7，均P<0.01）和PBS 组（54.6±8.2，P<0.01；70.2±6.7，P<0.05）。在MLR 中，DC:T 细胞=1:5 和1:10 两种条件下，LPS 组、ox-LDL 组SI 均明显高于LDL 组和PBS 组（均P<0.05）。在ox-LDL 组的MLR 中，以1.25、0.62、0.31 和0 μg/ml 的CTLA4Ig 处理的各亚组SI 分别为0.96±0.30，1.12±0.33，1.29±0.28 和1.64±0.37，TLA4Ig 浓度为1.25μg/ml 时，ox-LDL 激发的同种异体MLR 已被完全抑制。

    结论 ox-LDL 可作为抗原被DC 递呈，激发同种异体MLR；CTLA4 Ig 能明显抑制该作用，诱导T 细胞对ox-LDL 的免疫无反应。这一结果为动脉粥样硬化防治的研究提示了新的思路。

    氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）和树突状细胞（DC）被认为均参与了动脉粥样硬化（AS）的发生和发展，ox-LDL 可能作为抗原被DC 递呈给T淋巴细胞（T 细胞），引发致AS 的特异性免疫反应，导致局部炎症[1-2]。T 细胞的活化须有第一信号（TCR/MHC-Ag）和第二信号（共刺激信号）的共同作用，二者缺一不可。第一信号决定了作用的抗原特异性；第二信号是重要的辅助信号，缺乏或阻断共刺激信号可引起T 细胞的无反应性[3-5]。细胞毒性T 细胞（CTL）相关抗原（CTLA4）是CTL上的一种跨膜糖蛋白，其胞外区存在与相关配体B7分子结合的区域，而且其与B7 的亲和力是T 细胞表面分子CD28 的20～100 倍[6]。如果B7 与CD28结合，会完成辅助信号，促使T 细胞活化，产生免疫排斥；而如果B7 与CTLA4 结合，则CTLA4 胞内段磷酸化，会产生负调节信号，阻断T 细胞的活化。CTLA4Ig 是将CTLA4 的胞外区与人IgG Fc 段的CH2、CH3 及γ 区的氨基酸相结合而成的一种融合蛋白，仍保持与B7 结合的生物学特性[7]，却又具有了能溶于水和易于纯化的优点。CTLA4Ig 作为第二信号阻断剂，目前引起了研究者的关注，但研究主要集中在移植免疫和自身免疫性疾病方面，在心血管领域该方面的研究甚少。为了探索预防和延缓AS 发生和发展的新途径，我们观察了融合蛋白CTLA4Ig 对ox-LDL 诱导的T 细胞特异性免疫反应的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    RPMI-1640（英国Gibco 公司），10%胎牛血清（FCS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），细菌脂多糖（LPS，美国Sigma 公司，保存于–20℃），重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）（华北制药股份有限公司），重组人白细胞介素4（rhIL-4）（美国R&D 公司），淋巴细胞分离液（上海生物化学制剂厂），噻唑蓝（MTT）（碧云天生物技术研究所），乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（淄博三威化工厂），CTLA4Ig（美国R&D 公司）；6 孔和96 孔板细胞培养板（美国Corning 公司），L8-55M超高速离心机（美国Beckman 公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD 公司），3550 分光光度计（美国BioRADE 公司），DP20 倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）。白细胞及血清标本均取自健康成年志愿者。

    1.2 方法

    1.2.1 LDL 的分离和氧化 取健康志愿者空腹血清100 ml，于4℃ 2000 r/min 离心20 min。以顺序梯度离心法分离LDL。血清以KBr 调整密度至1.019 g/L，置于超高速离心机内，固定角度Type55.2Ti 转子，4℃条件下4 000 r/min 离心25 h，离心力ω2t=1.58×1012。去除上层的极低密度脂蛋白和乳糜颗粒，剩余溶液以KBr 调整密度至1.063 g/L，4℃条件下4 000 r/min 离心28 h，ω2t=1.77×1012。取上层LDL，经10%琼脂糖电泳鉴定为一条带；以Lowry 法测蛋白浓度为1488 μg/ml。取一部分LDL 加入终浓度为100 μmol/L 的EDTA，4℃透析24 h，0.22 μm 的滤器过滤除菌，4℃冰箱保存，为未被氧化的LDL；另一部分加入终浓度为10 μmol/L 的CuSO4，37℃氧化24 h，4℃透24 h，0.22 μm 的滤器过滤除菌，4℃冰箱保存，为ox-LDL。以比色法测得ox-LDL 的丙二醛含量为19.44 nmol/g 蛋白质。

    1.2.2 T 细胞、单核细胞的分离和DC 的诱导 利用梯度离心法[8]分离外周血单个核细胞。从外周血单个核细胞分离T 细胞、单核细胞，放入含RPMI-1640 的培养瓶中培养。于培养3 h 收集非黏附细胞，加入细胞冻存液，置液氮罐内保存，作为T 细胞备用。然后向培养瓶中加入含10% FCS 的RPMI-1640，加入终浓度500 IU/ml 的rhGM-CSF和500 IU/ml 的rhIL-4。3 d 后去除非黏附细胞。换液（含10% FCS 的RPMI-1640），补充rhGM-CSF和rhIL-4 继续培养3 d，以诱导DC。

    1.2.3 诱导细胞的表型分析和形态观察 取上述培养6 d 的细胞，用RPMI-1640 冲洗2 遍，取1×106个细胞以流式细胞仪检测CD14 表型；其他细胞放入含无血清RPMI-1640 培养基的6 孔培养板培养，每孔放入5×105/ml 细胞悬液3 ml。将培养细胞分为4 组，分别加入LPS 30 ng/ml（LPS 组，阳性对照）、ox-LDL10 μg/ml（ox-LDL 组）、LDL 10 μg/ml（LDL组）、相同体积的PBS（PBS 组，空白对照），作用48 h，收获各组细胞。取（2～5）×105 个细胞，以流式细胞仪检测CD86、HLA-DR 的阳性表达率和平均荧光强度（MFI），实验重复3 次；剩余的细胞用于进行同种异体混合淋巴细胞增殖反应（MLR）。

    1.2.4 CTLA4Ig 对同种异体MLR 的作用 取经不同刺激因子作用48 h 的细胞（即DC 细胞），用RPMI-1640 洗涤，1000 r/min 离心6 min，共3 次。将异体的非黏附细胞复苏、洗涤，调整细胞浓度为1×106 个/ml，作为异体T 细胞。按照DC:T 细胞=1:5和1:10 的比例将细胞接种于96 孔培养板。另设单纯T 细胞对照组。ox-LDL 组在DC:T 细胞=1:5 的试验中分为4 个亚组，其中3 组分别加入1.25、0.62、0.31 μg/ml 的CTLA4Ig，终体积200 μl；1 组为不加CTLA4Ig 的空白对照组，每组设3 个复孔，每孔均配对设单纯DC 对照孔。细胞增殖活性的检测采用MTT 比色法[9]。37℃、5%CO2 培养4 d，结束培养前4 h 每孔加入5 mg/ml 的 MTT 10 μl，孵育4 h，吸弃上清，每孔加酸化异丙醇100 μl，待完全溶解后用分光光度计于550 nm 测量吸光度（A）值，并计算刺激指数（SI）。SI=混合细胞组A值－单纯DC 对照组A 值/单纯T 细胞组A 值。实验重复3 次。

    1.3 统计学处理

    采用SPSS10.0 进行统计学分析。多个总体均数的比较采用单因素四水平设计定量资料的方差分析，多个总体均数的两两比较采用q 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 DC 的生成和表型分析

    健康成人的外周血单个核细胞贴壁培养3 h，得到的黏附细胞是单核细胞。加入rhGM-CSF 和rhIL-4 后3 d，可见细胞呈集落样生长；第6 天时倒置相差显微镜下观察，大部分细胞上浮，体积较大，形状不规则，有毛刺样突起（图1）。
   
    图1 用于诱导树突状细胞的单核细胞培养第6 天时倒置相差显微镜观察，可见细胞呈集落样生长，部分分散在集落旁的细胞有细长突触，呈现出典型的树突状细胞特征 ×450

    培养基中加入LPS 或ox-LDL 等刺激因子对细胞形态无明显影响。取培养6 d 的细胞检测细胞表型，CD14 的阳性表达率为2.9%，证明细胞已由单核细胞转化为DC。各组DC 以不同刺激因子作用48 h 后检测CD86 和HLA-DR 的表达（图2，表1），结果显示LPS 组和ox-LDL 组CD86 和HLA-DR 荧光表达率均明显高
于LDL 组和对照组（均为P<0.05）；ox-LDL 组CD86和HLA-DR 的MFI 明显高于LDL 组和对照组（P<0.01，P<0.05）。
   
图2 各组细胞CD86 和HLA-DR 表达的流式细胞术分析

    表1 各组细胞CD86 和HLA-DR 阳性表达率和MFI 比较（ x ± s ）

组别	阳性表达率（％）	阳性表达率（％）	MFI	MFI
	CD86	HLA-DR	CD86	HLA-DR
LPS	96.0±8.8*▲	90.3±8.8*▲	50.5±5.7	64.0±5.9
ox-LDL	97.7±11.4*▲	90.9±7.0*▲	73.4±6.6△	87.0±7.1*▲
LDL	90.0±10.0	84.4±9.6	40.0±7.4	55.0±7.7
PBS	87.3±8.4	83.6±7.0	54.6±8.3	70.2±6.7

    注：每组实验重复3 次；*与PBS 组比较，P<0.05，△与PBS 组，P<0.01；▲与LDL 组比较，P<0.05；﹟与LDL 组比较，P<0.01

    2.2 CTLA4Ig 对同种异体MLR 的作用

    ox-LDL 10 μg/ml 可明显刺激同种异体MLR，ox-LDL 组SI 明显高于PBS 组和LDL 组（表2）。CTLA4Ig 可明显抑制ox-LDL 激发的同种异体MLR，在CTLA4Ig 浓度为1.25、0.62、0.31、0 μg/ml时，SI 分别为0.96±0.30、1.12±0.33、1.29±0.28、1.64±0.33，呈明显的剂量依赖效应。CTLA4Ig 浓
度为1.25 μg/ml 时，ox-LDL 激发的同种异体MLR已被完全抑制。

    表2 同种异体MLR 中各组细胞刺激指数比较（ x ± s ）

组别	刺激指数 SI	刺激指数 SI
	DC:T=1:5	DC:T=1:10
LPS	1.75±0.32*△	1.69±0.30*
ox-LDL	1.67±0.32*△	1.55±0.27*△
LDL	1.42±0.29	1.34±0.30
PBS	1.32±0.24	1.29±0.30

    注：每组试验重复3 次；*与PBS 组比较，P<0.05；△与LDL 组比较，P<0.05

    3 讨论

    目前的研究认为，特异性免疫反应参与了AS的发生和发展[9]。ox-LDL 被认为是最重要的抗原。人和动物的AS 病变中均发现ox-LDL 的存在[10]。临床研究也发现，人血清中的抗ox-LDL 滴度与AS病变的进展明显相关[11]。从人的AS 斑块中分离出的T 细胞能特异性地识别ox-LDL，进一步证明ox-LDL 是AS 的特异性抗原[12]。抗原递呈是特异性免疫反应中的重要环节，抗原通过抗原递呈细胞递呈给T 细胞，激发淋巴细胞针对抗原的特异性免疫反应。DC 是最重要的抗原递呈细胞[13]，能摄取和处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞，同时表型也向成熟转变[14]。DC 可参与AS 发生和发展的各个阶段，在AS 病变和正常人动脉的AS 易患区，均有DC 的聚集[15-17]。但是目前尚缺乏ox-LDL 和DC参与AS 的直接证据。本研究结果显示，LDL 被氧化成ox-LDL 后具有了与LDL 不同的免疫原性，可诱导DC 表型向成熟发展，并可以作为抗原被DC递呈，有效地激发同种异体MLR，表明ox-LDL 可能作为抗原、DC 可能作为抗原递呈细胞参与致AS的特异性免疫反应。

    阎衡等[18]的研究表明，应用CTLA4Ig 可抑制植物血凝素、LPS 和金黄色葡萄球菌肠毒素B 刺激的T 细胞增殖。陈希炜等[19]在对小鼠脾淋巴细胞的研究中发现，CTLA4Ig 不仅能抑制刀豆蛋白A（ConA）刺激的T 细胞增殖，并能明显抑制同种异体小鼠的双向混合T 细胞反应。以上的实验均表明，CTLA4Ig 能明显阻断T 细胞活化所需要的第二信号通路，从而抑制T 细胞的增殖。但是，以上实验都是抗原非特异性的， 尚不能证明CTLA4Ig 能否诱导T 细胞对特异性抗原的免疫耐受。本研究以ox-LDL 刺激的DC 激发同种异体MLR，探讨CTLA4Ig 对该反应的影响。结果显示在应用CTLA4Ig 后，同种异体MLR 被明显抑制，并呈明显的剂量依赖效应，在CTLA4Ig 浓度为1.25 μg/ml 时，ox-LDL 激发的MLR 已被完全抑制。表明CTLA4Ig 可阻断T 细胞激活所需的第二信号通路，在体外成功诱导出T 细胞针对ox-LDL 的免疫无反应性。

    本研究结果提示，可以从CTLA4Ig 诱导免疫耐受的角度来探讨AS 的发病机制及其防治途径。但是，这方面还有很多问题需要深入探讨。例如，CTLA4Ig 引发的免疫耐受是通过CD4 细胞途径得到的，还是通过CD8 细胞途径得到的；CTLA4Ig诱导的免疫耐受的持续时间；CTLA4Ig 在阻断T细胞CD28 与DC B7 结合的同时，也阻断了T 细胞CTLA4 与B7 的结合，从而阻断了CTLA4对免疫反应的负调节作用， 这对长远的免疫反应调节是否有影响；CTLA4Ig 在体内能否诱导对ox-LDL 的免疫耐受及对AS 的影响等。这些都需要进一步的研究来回答。

    CTLA4Ig 可诱导T 淋巴细胞对氧化修饰低密度脂蛋白的免疫无反应性