| 动脉粥样硬化易感性与Rb基因多态性相关性研究 |
|
| 作者：郑强荪 舒… 文章来源：《第四军医大学学报》2001年8月22卷16期 点击数： 更新时间：2007-9-17 |
摘 要：目的 探讨人类动脉粥样硬化（atheroscleosis，AS）的遗传易感性与Rb基因（intron20）多态性的相关性。方法 采用病例-对照分子流行病学方法，以PCR-STR技术，分析了107例动脉粥样硬化患者和68例老年对照组进行Rb基因内含子20多态性的检测。结果 在动脉粥样硬化群体发现：等位基因片段18个，片段大小在390～260bp之间，重复片段大小为5bp，杂合率为0.62，PIC（信息量）：0.91。与对照组比较该位点多态分布差异有显著性（P<0.05），其中：>310bp片段增多（AS：40.2%，对照：28.7%），VNTR重复数量:动脉粥样硬化群体>对照群体；PIC增高（AS：91%，对照：85%）；杂合率降低（AS：61.7%，对照：67.6%）。结论 Rb基因VNTR重复数量的增多可能是老年人易患动脉粥样硬化的因素之一。
引言
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是人类动脉一种常见的疾病，属于多基因遗传病，由于累及心、脑血管等重要部位，可导致严重后果。动脉内膜增厚、平滑肌细胞迁移与增殖是动脉粥样硬化形成过程中的关键，抗癌基因在调节增殖和表型转化方面起重要作用。Rb基因是研究的较深入的抗癌基因，位于13q14，具生长负调节作用［1］。Chang等［2］ 实验证实Rb基因产物对AS或球囊内膜损伤后平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用。STR是人类基因组内具有高度多态的遗传标记，但有关Rb基因（20内含子）多态性与动脉粥样遗传易感性的关系研究未见报道。我们对动脉粥样硬化群体Rb基因的STR多态性研究，探讨其与人类动脉粥样遗传易感性的关系，以期从该角度探讨人类动脉粥样硬化的发生发展机制。
1 对象和方法
1.1 对象 动脉粥样硬化患者外周血标本107例（急性心肌梗死，或经选择性动脉造影有狭窄和/或超声多普勒发现有粥样斑块），为本校唐都医院心脏内科住院患者，年龄（60±5）岁.对照组68例（经动脉造影和超声多普勒检查无狭窄和粥样硬化斑块），年龄（60±5）岁，为唐都医院心脏内科住院患者。
1.2 方法 用常规酚-氯仿法由外周血白细胞中提取基因组DNA，以PCR扩增对象的基因组DNA中Rb基因20内含子多态性，PCR反应引物序列为：A5'-CTCCTCCCTACTTACTTGT-3'，B5'AAT-TAACAAGGTGTG GTGG-3'（美联公司合成）。反应总体积为30μL，依次加入灭菌双蒸水，10×缓冲液3μL，引物各25pmol，dNTP2.5mmol・L-1 2.4μL，Taq酶2.5U（上海Promega公司），DNA模板约0.5μg。扩增条件：97℃变性10min，经94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，循环30次，最后以72℃延伸10min结束反应。PCR扩增在PE DNA thermal cycle上进行。PCR扩增产物用8g・L-1 聚丙烯酰胺凝胶（Gibco公司）电泳，160V电泳4h，溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照相。以Pbr322/MSP I为Marker。
统计学处理：计算各组基因频率、基因型频率，按Hardy-Weinberg平衡法确定各样本的群体代表性。组间基因频率的比较用χ2 检验。基因杂合度（H）及多态信息量（PIC）计算实用Cooper的方法。
2 结果
2.1 陕西正常老年人群Rb基因内含子20位点STR区的多态分布 68例对照组基因组DNA经PCR检测后，发现多态片段18个，片段大小在390～260bp之间，频率分布在0.007～0.228。其中≥300bp占55.1%，≤300bp占44.9%，高峰在300bp（35.3%）。该位点杂合率为：0.68，PIC信息量：0.85。
2.2 动脉粥样硬化患者（AS）Rb基因内含子20位点STR区的多态分布 107例动脉粥样硬化患者外周血标本基因组DNA经PCR检测后，发现多态片段18个，大小在390～260bp之间，频率分布在0.01～0.17。其中≥300bp占65.4%，<300bp占34.6%，高峰在310bp（25.2%）。该位点杂合率为0.62：PIC（信息量）：0.91。将其基因频率分布与对照组比较差异有显著性（χ2 =25.8，df=15，P<0.05），≥310bp片段增多（AS：23.4%，对照：12.5%），VNTR重复数量：动脉粥样硬化群体>对照群体；PIC增高（AS:91%，对照:85%）；杂合率降低（AS：61.7%，对照：67.6%）。
3 讨论
Rb具有抑制细胞增殖的作用，其作用主要通过结合与抑制转录因子E2F，该作用受到细胞周期依赖的磷酸化调节。Rb也可通过抑制RNA聚合酶I和RNA聚合酶Ⅲ的转录作用，控制细胞的生长［3］。Rb因其基因突变而失活的现象已在不少恶性肿瘤中发现，如：食管癌、白血病、骨肉瘤［4-7］。因动脉粥样硬化发生心、脑意外事件死亡的居疾病死亡率中的首位，近年来，该病在我国的发生也有增高的趋势。但动脉粥样硬化的病因及发病机制尚未清楚.动脉内膜增厚、平滑肌细胞迁移与增殖是动脉粥样硬化形成过程中的关键，抗癌基因在调节增殖和表型转化方面起重要作用。在高胆固醇喂养的兔主动脉粥样硬化斑块中发现Rb基因表达降低［8］；将重组Rb基因的腺病毒载体导入培养的兔主动脉平滑肌细胞，发现其表达产物对平滑肌细胞增殖有抑制作用［9］。利用脂质体包裹Rb、P53 基因的反义寡核苷酸导入人血管平滑肌细胞，发现DNA转录水平提高，血管平滑肌细胞数量增多，从而证实Rb，P53 基因对血管平滑肌细胞增殖的负调控作用［10，11］。但动脉粥样硬化群体的Rb基因STR多态性未见报道。
随着限制性内切酶、DNA分子杂交、PCR技术的发现与发展，人类群体遗传学的研究进入了直接分析DNA多态性的阶段，遗传标记如：RFLP，VN-TR，STR。VNTR和STR多态性起因于复制过程中的滑动［12］，它广泛存在基因组中，PIC高，是理想的遗传标记。在Rb基因20内含子存在STR位点，其核心序列为CTTT（T）n，N=14-26［13］。我们对动脉粥样硬化患Rb基因（intron20）位点检测结果显示：①群体符合Hardy-Weinberg平衡，群体具有代表性。该位点杂合率高（对照组：0.68），信息量大（对照组：0.85），是一个较理想的遗传标记位点。②将动脉粥样硬化群体与对照组对比发现：基因频率分布差异有显著性，PIC增高，杂合度降低。>310bp片段数量增多（28.7%→40.2%），高峰点增大（300bp→310bp），结果提示该位点多态性改变（重复性增多）与动脉粥样硬化群体易感性可能有一定的相关性，可能重复性增多，导致基因不稳定，由此产生细胞增殖异常。然而动脉粥样硬化的发生、发展有着极其复杂的机制，随着分子遗传学研究的不断深入，对进一步阐明动脉粥样硬化发病机制和防治具有重要意义。
参考文献：
［1］Mcgee TM，Yandell DW，Dryja TP.Structure and partial ge- nomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene ［J］.Gene，1989;32（80）:119-128.
［2］Chang MW，Barr E，Seltzer J，Jiang YQ，Nabel GJ，Nabel EG，Parmacek M，Leiden JM.Cytoststic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastma gene product ［J］.Science，1995;267（27）:518-522.
［3］Weinberg RA.The Retinoblastma protein and cell control ［J］.Cell，1995;81（3）:323-330.
［4］Shu Q，Ma QF，Liu SY，Zhang N.Genetic polymorphisms of Rb and susceptibility of esophageal cancer ［J］.Zhonghua Waike Zazhi（Chin J Surg），2000;38（5）:375-377.
［5］Shu Q，Zeng RP，Liu SY，Gao Q，Du CS.Analysis of Rb gene in primary acute lymphoid leukemia ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1996;17（3）:172-174.
［6］Shu Q，Ma Qf，Qin Hy，Zhang N.Analysis of genetic polymor-phisms of Rb in esophageal cancer ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（1）:86-87.
［7］Belchis DA，Meece CA，Benko FA，Rogan PK，Williams RA，Gocke CD.Loss of heterozygosity and microsatellite instability at the retinoblastoma locus in osteosarcomas ［J］.Diagn Mol Pathol，1996;5（3）:214-219.
［8］Bennett MR，Macdonald K，Chan SW，Boyle JJ，Weissberg PL.Cooperative interactions between Rb and P53regulate cell proliferation，cell senescence，and apoptosis in human vascular smooth muscle cells from atherosclerotic plaques ［J］.Circ Res，1998;82（6）:704-712.
［9］Wang HH，Liu BW，Fu MD，Zeng CL.Transcriptional expres-sion of oncogenes and Rb antioncogene in experimental atherosclerotic lesions ［J］.Huaxi Yike Daxue Xuebao（J West Chin Univ Med Sci），1996;27（2）:117-121.
［10］Li J，Xia Y，Jiang L.Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation by introduction of retinoblastma gene via a recom-binant adenovirus vector ［J］.Chin Med J，1997;110（12）:950-954.
［11］Aoki M，Morishita R，Matsushita H，Haysushita H，Hayashi S，Nakagami H，Yamamoto K，Moriguchi A，Kanada Y，Higa-ki J，Ogihara T.Inhibition of the p53tumor suppressor gene re-sult in growth of human aortic vascular smooth muscle cell.Po-tential role of p53in regulation of vascular smooth muscle cell growth ［J］.Hypertension，1999;34（2）:192-200.
［12］Stephan W，Cho S.Possible role of natural selection in the for-mation of tandem-repetitive noncoding DNA ［J］.Genetics，1994;136（1）:333-341.
［13］Yandell DW，Dryja TP.Detection of DNA sequence polymor-phism by enzymatic amplification and direct genomic sequencing ［J］.Am J Hum Gene，1989;45（4）:547-555. |
|
上一篇文章： 重视血栓栓塞疾病的预防
下一篇文章： 没有了 |
| 【发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口】 |
