过氧化体增殖物激活型受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPAR）是配体活化型的核转录因子，属于核受体超家族，它在转录水平上调节脂质代谢和细胞因子的产生^[1]。尽管动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征的的发病机制还不十分清楚，然而炎症反应，尤其是巨噬细胞和炎症因子引起的不稳定性斑块裂隙或破裂，在其发病中的作用获得多数学者的认可^[2]。本研究采用曲格列酮（Trog）为过氧化体增殖物激活型受体-r（PPAR-r）的配体，在细胞分子水平上研究配体活化型PPAR-r对巨噬细胞脂蛋白受体和炎症因子表达水平的影响。

    材料与方法

    1．分离脂蛋白及其处理：采集单纯高甘油三酯血症新西兰大白兔血浆，由非离子碘化的密度梯度超速离心^[3]获低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）（包括中间密度脂蛋白IDL及残粒），采用Cu²⁺（CuSO4）将LDL氧化修饰为氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）^[4]，以胰蛋白酶消化VLDL，从而去处载脂蛋白（apo）E的影响^[5]。

    2．细胞培养与分组：采用10%胎牛血清RPMI1640培养基进行U937-人类单核细胞株细胞培养，加入佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA；100ng/ml）细胞培养液12h（37℃）使之转变为巨噬细胞，调整细胞数为1×106/ml，转至24孔培养板或75cm2瓶，更换无血清RPMI1640培养基。根据干预因子和刺激因子不同而分为5组：（1）对照组：无血清培养48h的巨噬细胞1×106/ml（简称单纯巨噬细胞）。（2）VLDL组：VLDL116ug/ml+单纯巨噬细胞培养48h。（3）ox-LDL组：ox-LDL 20ug/ml+单纯巨噬细胞48h。（4）Trog-PPAR-r+VLDL+单纯巨噬细胞培养48h，Trog，终浓度为50umol/L。（5）Trog-PPAR-r+ox-LDL+单纯巨噬细胞培养48h。

    3．采用免疫组话剧[以异硫酸脂荧光素（FITC）标记的二抗通过激光扫描共聚焦显微镜]、32P放射性同位素标记和Northern杂交分别检验Trog-PPAR-r对各组巨噬细胞清道夫受体（SRA）、TNF-a、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和VLDL受体（VLDLR）的mRNA及蛋白表达的影响。

    免疫组化采用细胞涂片免疫荧光染色方法：将分化后继续培养48h的细胞，制备为细胞悬液（100ul，细胞数为107/ml），载玻片用多聚赖氨酸处理，吸取10ul细胞悬液均匀涂于载玻片上，待涂片稍干后加入丙酮固定5min，然后37℃烤箱烤干涂片，密封置于20℃冰箱待用。免疫荧光染色法：用间接法，取待用细胞涂片用PBS洗2次，用10%羊血清反应15～20min，以消除非特异性干扰，吸干血清加入适当稀释的一抗，37℃温浴作用1h，PBS洗2次×5min，滴加FITC标记的二抗，37℃作用1h，请水冲洗3次，用甘油缓冲液（甘油和pH为9.0～9.5的0.5M碳酸缓冲液等量混合）封固，共聚焦显微镜进行检查，了解细胞的抗原表达情况及分布。

    32P放射性同位素标记^[6]：采用Boehringer公司提供的DNA5'末端标记试剂盒，按操作说明进行。简述之(1)去磷酸化：用缓冲液A按1：4将1ul碱性磷酸酶稀释，取稀释液1ul加入对照DNA中。将8ul缓冲液A加入72ul水中，再加入碱性磷酸酶1ul(与缓冲液A按1：2稀释)于标准中。以上各液体加好后37℃孵育30min，加入50mmol/L EDTA 20ul，65℃作用30min后冷却，加入100ul酚，离心后保留液相，反复采用酚抽提，加入500ul氯仿混合离心，去处顶层相，反复氯仿抽提，在液相层加入8M氯化锂0.1容积和2.2容积冰乙醇，混合并于70℃冷却，4℃离心15min，去除上清，沉淀物中加入70%乙醇1ml，重复2次。(2)5'末端自由5'-OH端标记：将对照反映及标准反应的去磷酸化DNA片段，按1ul缓冲液C和10pM[r-32P]ATP比例混匀，加入T4多聚核肽激酶，混合37℃作用30min， 冰浴中止反应。（3_32P探针纯化将10gSephadex G-50加入TE中，待充分膨胀后，弃上清高压蒸汽灭菌，装填SephadexG-50凝胶柱，用STE缓冲液体[0.1MnaCL，10 nmol/L Tris-HCI(Ph8.0)及1mmoL/L EDTA (Ph8.0)]洗柱，分别将32P标记好的cDNA探针上柱，收集流出液(每管200ul)，第一峰流出液混匀，-20℃保存.取少量混合液测定32P探针放射性比活性，100ul样点于玻璃纤维膜上。另100ul加入5ml 10%三氯乙酸和95%乙醇洗膜。两张滤膜干燥后，置于闪烁瓶内，液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)。

    Northern杂交^[7]：（1）在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳：琼脂糖溶于水，冷却至60℃加入已配制好的5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛，至终浓度为1×2.2mmol/L，置室温30min，使凝胶凝固，建立以下反应体系：RNA4.5ul，5×甲醛凝胶电泳缓冲液2.0ul、甲醛3.5ul及甲醛胺10.0ul，将其反应体系于65℃反应15min，冰浴冷却，离心至管内液体集中于管底，加入2ul甲醛凝胶加样缓冲液，用已经18SS和28SrRNA作为分子量标准参照物，将样品加入凝胶加样孔内，侵入1×甲醛凝胶电泳缓冲液，3～4V/cm电压进行电泳，结束后切下分子量标准参考物的凝胶条，溴化乙淀染色30min，紫外灯下照像。（2）变形RNA移至尼龙膜：塑料盘内倒入足够量的20×SSC侵透，平放在玻璃板上，将中和好的凝胶置于滤纸中央，置尼龙膜在凝胶上，盖6层滤纸于尼龙膜上，其上放10cm的卫生纸，最上面放一块玻璃板，并压600g左右的物品，室温下转膜18h。转膜完毕，在滤膜上标记凝胶加样孔位置，用6×SSC洗膜后，室温晾干。（3）膜上印记杂交：置以上转好的RNA尼龙膜于寡核苷酸预杂交液[包括2×SSC、0.01M磷酸 pH6.8、1mmol/L EDTA Ph 8.0、0.5% SDS、100ug/ml（x±s）精DNA及0.1%脱脂奶粉]中作用2h，加入变形的放射性32P标记好的VLDLR、SRA、PPAR-r及MMP-9探针0.2ul，其放射性比活性大于2×108，于45℃杂交1h，然后用6×SSC漂洗，将滤膜用保险膜包好，置于暗盒中，置磷钨酸钙增敏屏(前屏)于滤膜上，再加压1张X胶片(Kodak XAR)，胶片上压上增敏后屏，进行放射自显影，-70℃曝光72h，取出X胶片显影、定影。

    几种探针的cDNA序列如下：
    SRA为5‘-CCC ACT TCA GGA GTT GAG CTG GCA TTA TTG CGA TSA GAGG-3’
    VLDLR为5‘-TAA CCC TTT TTA TCC TAT TGC CAT TGT CCC-3’
    PPAR-r为5‘-TCC GCC CAA ACC TGA TGG CAT TAT GAA ACA TCC CCA CAGC-3’

    4．统计学处理：计量资料用（x±s）表示，统计学处理采用Microsoft excel软件进行方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。
 
    结　果
   
    1．Trog-PPAR-r对巨噬细胞SRA、TNF-a和MMP-9蛋白表达的影响：从表1可见：（1）VLDL使巨噬细胞TNF-a和MMP-9蛋白表达量明显增加，Trog作为PPAR-r配体，活化后能明显减少其他蛋白表达量，然而VLDL组或Trog-PPAR-r+VLDL组均无明显地影响巨噬细胞SRA蛋白表达量；（2）ocx-LDL使巨噬细胞SRA、TNF-a和MMP-9蛋白表达量明显增加，而Trog-PPAR-r+ox-LDL组均明显减少巨噬细胞SRA、TNF-A和MMP-9蛋白表达量。


    激光扫描共聚焦显微镜观察结果表明，SRA在细胞膜表达，而TNF-a和MMP-9为典型的胞浆染色，呈“月牙型或肾型”。

    2．Trog-PPAR-r对巨噬细胞SRA、VLDLR、PPAR-r mRNA表达的影响：SRA cDNA探针可检测到3.2kb mRNA显影带(杂交信号)，ox-LDL组的SRA mRNA显著高于对照组，Trog-PPAR-r能显著降低ox-LDL介导的巨噬细胞SRA基因转录，VLDL对巨噬细胞SRA基因表达无明显影响(图1)；VLDL组中VLDLR Mrna(3.6kb)表达量香烛高于对照组，而ox-LDL对其表达量影响不明显，Trog-PPAR-r能显著降低VLDL介导的巨噬细胞VLDLR mRNA表达(图2)；PPAR-r cDNA探针可检测到2.1kb mRNA杂交信号，U937人类单核细胞株无PPAR-r mRNA表达但巨噬细胞为阳性表达，Trog- PPAR-r能显著增加其表达量，但VLDL和ox-LDL的作用却不明显。


    讨　论

    无血清培养的巨噬细胞与VLDL或ox-LDL或Trog-PPAR-r孵育24h后结果表明(1)单核细胞转变为巨噬细胞即能表达SRA、VLDLR、TNF-a和MMP-9，乃至PPAR-r，但U937人类单核细胞却无PPAR-r表达。（2）VLDL刺激因子仅使巨噬细胞VLDLR mRNA表达量增加；ox-LDL只使巨噬细胞SRA mRNA和蛋白表达。（3）无论VLDL或ox-LDL均能诱导巨噬细胞TNF-a和MMP-9蛋白表达增加。（4）Trog作为PPAR-r的配体，使巨噬细胞PPAR-r mRNA表达量增加，而且在ox-LDL或VLDL刺激条件下，能抑制其SRA、VLDLR、TNF-a和MMP-9的表达。

    我们的实验结果再一次证实，来源于单核细胞的巨噬细胞生物学特征与前者显著不同。在脂蛋白（ox-LDL或VLDL）刺激下，尽管巨噬细胞活化脂蛋白受体表达类型即SRA或VLDLR不同，但均使其TNF-a和MMP-9的mRNA及蛋白表达量明显增加。PPAR-r在其配体，它的作用主要是使脂肪组织脂蛋白脂酶表达增加，甘油三脂分解加速[8]。然而，在ox-LDL或（和）VLDL刺激下，活化的无血清培养的巨噬细胞膜上SRA或（和）VLDLR mRNA和蛋白表达均增强，Trog活化的PPAR-r在有效地抑制巨噬细胞膜炎症因子表达的同时^[9]，亦能有效地抑制巨噬细胞膜上的SRA或VLDLR的表达，即有效地抑制巨噬细胞对脂质（VLDL和/或ox-LDL）的摄取。鉴于巨噬细胞是动脉粥样硬化不稳定性斑块的主要构成细胞，急性冠状动脉综合征者富含巨噬细胞区与整个斑块的比率增高，活化的巨噬细胞分泌大量的炎症因子，在富含脂质的不稳定性斑块的损伤过程中起着重要的调控作用^[2]。因此，增强配体活型PPAR-r的表达，既有抑制巨噬细胞炎症因子的表达，也能抑制巨噬细胞对脂质[VLDL和（或）（ox-LDL）]的摄取，在防治动脉粥样硬化，尤其是不稳定性斑块破裂和急性冠状动脉综合征可能起着一定的作用。
 
参考文献
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4 Calvo D，Coronado D，Suarez Y，et al.Human CD36is a high affinity receptor for the native lipoproteins using self-generating gradients of lipoprotein HDL，LDL and VLDL.J Lipid Res，1998，39:777-888.
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6 Zhang J，Desai M，Ozanne SE，et al.Two variants of quantitative reverse transcripatse PCR used show differential expression of alpha-beta-and gamma-fibrinogen genes in rat liver lobes.Biochem J，1997，321:769-775.
7 Zhang J，Byrne CD.A novel highly reproducible quantitative competive RT-RCR system.J Mol Biol，1997，274:338-352.
8 Torra IP，Gervois P，Staels B. Peroxisome proliferator-actevated receptor alpha in metabolic disease，inflammation，atherosclerosis and aging.Curr Opin Lipidol，1999，10:151-159.
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