一、氧化应激概述

    氧化应激是指化学因子和环境因素作用使自由基产生增多和(或) 抗氧化机制减弱，引发组织的应激反应，从不同水平导致组织细胞的损伤，引发多种疾病。

    氧是生物体供能的主要来源，也是合成ATP、激素及许多生理活性物质所必不可缺的物质。但机体在利用氧元素进行氧化反应的同时，氧元素自身也发生了还原反应,生成活性氧代谢产物，是具有不配对电子的分子、离子或基团，主要包括超氧阴离子自由基(O2-) 、过氧化氢(H2O2 ) 、羟自由基(OH.)以及由此衍生的有机过氧化物自由基（RO﹒和ROO﹒）和氢过氧化物（ROOH）等，统称为氧自由基或活性氧族( reactive oxygen species，ROS)。正常状态下机体可产生少量ROS参与正常代谢，同时体内存在清除自由基、抑制自由基反应的体系，使得过多的自由基被清除或使自由基减少，ROS的产生和清除处于动态平衡状态。如果这一机制遭到破坏，则过多的自由基可直接作用于机体，引起组织损伤。
 

    活性氧的负性作用主要在于其结构中含有未成对电子，具有高度反应性，能够迅速与周围物质发生反应。ROS过多积聚，对核酸、蛋白质和脂肪均具有损害作用。损伤机制如下：

    ①对核酸和染色体的破坏。ROS可以氧化修饰核酸的碱基，导致DNA损伤和DNA链的断裂，染色体的畸变和断裂。

    ②对蛋白质、酶的损伤。在ROS的作用下，胞浆和膜蛋白及某些酶可交联成二聚体或更大的聚合物，导致蛋白质变性，功能丧失和酶失活。氧化应激对蛋白质损伤的一个重要标志物是硝基酪氨酸（nitrotyrosine,NT），是自由基与蛋白质中的酪氨酸残基相互作用的产物。

    ③对脂类和细胞膜的破坏。ROS与膜磷脂的不饱和脂肪酸作用，发生脂质过氧化反应，改变膜的结构，使膜成分之间形成交联和聚合，影响膜受体、膜蛋白酶和离子通道的功能。

    ④对细胞外基质的破坏。使细胞外基质变得疏松，弹性降低。氧化应激严重影响细胞周期和凋亡过程。    

    二、糖尿病氧化应激的产生

    越来越多的动物实验和临床研究证实糖尿病中氧化应激的存在。糖尿病状态时促进氧化应激的因素包括：反应性氧自由基增加，糖基化产物和糖氧化产物形成增加和抗氧化应激机制的减弱。

    糖尿病慢性高糖状态可以通过以下途径产生大量的活性氧族：

    1 高血糖导致内皮细胞线粒体生成超氧阴离子增多。

    血糖水平升高时，葡萄糖以非胰岛素依赖性方式在内皮细胞膜上葡萄糖转运体21 (GLUT21) 的帮助下进入细胞，造成细胞内高糖状态。过多的葡萄糖经糖酵解途径代谢生成丙酮酸，后者经三羧酸循环提供过多的供氢体（NADH 和FADH2）给线粒体呼吸链，从而使ROS，特别是超氧阴离子生成增加。

    2 蛋白质糖化作用增强。

    长期高血糖使各种蛋白质发生糖基化，许多长寿蛋白质如胶原蛋白随着糖化时间延长而不断糖化，形成糖基化终末产物(AGEs)堆积，而AGEs形成过程中可以不断产生自由基。

    3 高糖可引起醛糖还原酶（AR）和山梨醇脱氢酶（SDH）活性增强。

    一方面导致细胞内山梨醇和果糖浓度增高，引起细胞水肿和损伤；另一方面使多元醇通路中底物增加，NADPH/NADP的比值下降，从而导致超氧阴离子的产生。

    4 花生烯酸类代谢途径的激活。

    5 抗氧化系统清除能力减弱。

    正常情况下，机体可利用酶和抗氧化剂通过化学反应达到清除组织内自由基的作用。糖尿病情况下机体内抗氧化物质如超氧化物歧化酶(SOD) 活性降低，还原型谷胱甘肽、抗坏血酸等血浓度下降，明显削弱了机体清除自由基的能力。

    6 其他

    糖尿病状态时伴随的肥胖、脂代谢紊乱、游离脂肪酸水平增加和血管紧张素Ⅱ的激活等，均增加ROS生成。

    三、 氧化应激与糖尿病血管病变

    2型糖尿病本身具有血管病变的特征,在新诊断的2型糖尿病患者中约有50%的患者已经存在不同程度的血管病变,在糖耐量减低( IGT)人群约有40%的患者存在血管病变,在仅空腹血糖受损( IFG)人群中血管病变的比例也达到10%。一旦高血糖达到临床诊断标准,持续慢性的高血糖状态便加速了糖尿病微血管和大血管病变的 发展与恶化。氧化应激引起的胰岛素抵抗和自由基对胰岛β细胞的直接和间接损伤成为2型糖尿病的发病机理之一。氧化应激成为损伤β细胞、加重胰岛素抵抗以及导致各种血管并发症发病中的共同通路。

    大量研究表明氧化应激可能是糖尿病血管并发症的始动因素。糖尿病状态下产生大量ROS，ROS通过激活多种途径参与一系列生物效应，包括细胞的生长、凋亡、迁移，炎性分子的表达，基质成分的调控，导致血管内皮细胞损伤，平滑肌细胞增生、迁移，细胞外基质增生，血管通透性增加，新生血管形成，血管舒缩功能紊乱等一系列病理生理改变，引起糖尿病血管并发症。

    高血糖引起血管并发症机制的研究目前主要集中于4条通路：多元醇通路的激活、糖基化终末产物(AGEs) 形成增多、蛋白激酶C(PKC) 途径激活及氨基己糖途径的激活。最近的研究发现上述4种机制存在着单一的高血糖诱导的过程, 即线粒体电子传递链超氧化物过量产生。高血糖诱导的线粒体ROS过量产生是引起血管内皮细胞损伤的多条通路激活的共同途径，是糖尿病血管病变发病机制中的关键因素。现将线粒体ROS过量产生激活血管损伤通路及其信号调节机制总结如下：

    1 氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)作为致动脉粥样硬化的关键因素早已被证实。
 

    在高糖状态下，低密度脂蛋白(LDL) 更容易被氧化。在活性氧攻击系统的作用下，LDL可发生不间断的、不同层次的氧化。LDL 氧化修饰后生物学特性发生了明显改变，形成大量脂质过氧化物以及有较高活性的中间产物，不能再被LDL受体识别、代谢，而被清道夫受体(SR) 与其他受体识别，使之被巨噬细胞吞噬,进入到巨噬细胞内引起胆固醇积聚，使巨噬细胞演变为泡沫细胞。Ox-LDL还可以诱导单核细胞膜上白细胞黏附分子、单核细胞趋化蛋白及白细胞介素（IL-1）的产生，促进纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的生成，抑制一氧化氮（NO）生物活性，使NO的血管保护作用减弱。此外，Ox-LDL对糖尿病微血管病变的发生也有促进作用。高水平的Ox-LDL具有细胞毒性作用，可直接损害肾小球小动脉的血管内皮细胞及平滑肌细胞，从而使蛋白容易滤过，出现蛋白尿。除了上述直接作用外，Ox-LDL还可以通过对内皮和血小板功能的影响加重糖尿病肾病。

    2 蛋白激酶C（PKC）途径激活。

    PKC是处于细胞内诸多信号通路中心具有重要生理功能的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。高糖引起的线粒体ROS过量产生可抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 的活性，使糖酵解中间产物堆积，3-磷酸甘油醛增多，刺激二脂酰甘油(DAG)从头合成，激活PKC；此外，AGEs、游离脂肪酸、血管紧张素Ⅱ及多种细胞因子也能促进PKC的激活。PKC 激活后与下游效应器相互作用，影响心血管细胞周期以及多种细胞因子的表达。促进转化生长因子β(TGF-β)表达和细胞外基质蛋白包括胶原、纤维粘接蛋白的生成，导致细胞外基质的增生，基底膜增厚；促进内皮细胞间黏附分子、PAI-1 的表达，刺激血管平滑肌细胞增殖；影响内皮素1(ET-1)及一氧化氮合酶(NOS)的表达，导致血流及血管舒缩功能紊乱；介导促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、前列腺素、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子的产生，使血管通透性增加，促进新生血管的生成。这些生物效应均参与了糖尿病大血管和微血管病变的发病过程。

    3 糖基化终末产物(AGEs)形成增多。

    在糖尿病中，除活性氧自由基对细胞膜上脂类与蛋白质直接作用外，糖类自身氧化产物也具有高度的氧化活性，它能与细胞膜上的蛋白质、脂质起反应，引起蛋白质变性及脂质氧化。此种糖类自身产物称为AGEs。线粒体ROS过量产生抑制GAPDH活性使3-磷酸甘油醛增加，可分解产生AGEs前体分子甲基乙二醛，参与AGEs生成。组织中AGEs的聚集能引起多种病理过程，它对细胞的毒性作用是通过与其特异性受体糖基化终末产物受体(RAGE)的结合来实现的。RAGE 在许多细胞(包括内皮、系膜、血管平滑肌细胞及巨噬细胞)中均有表达，这与糖尿病血管并发症有密切关系。AGE-RAGE反应伴随ROS的产生，能够增加血管通透性，促进单核细胞的流动；AGEs促进LDL的氧化,加重动脉粥样硬化的形成；AGE－RAGE促进ROS的产生，促进膜的氧化，增加膜的通透性，并激活磷脂酶A2 (PLA2)，通过PKC作用使前列腺素合成增加，增加肾小球的通透性及肾血流量, 保持肾小球高滤过状态。AGE-RAGE 反应主要通过对自由基敏感的核转录因子κB(NF-κB) 途径缓慢诱导产生大量的细胞因子及生长因子，如血小板源性生长因子(PDGF) 、ET-1、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、IL-1、TGF-β等。所有这些细胞因子及生长因子共同构成复杂的细胞因子网络，并以自分泌及旁分泌方式作用于肾细胞，导致肾细胞增殖、肥大，细胞合成过多的胶原蛋白，细胞外基质增多，降解减少，造成肾小球硬化及肾脏细胞外基质的沉着。

    4 多元醇途径激活对糖尿病血管并发症的影响。

    在醛糖还原酶高表达的转基因鼠中早已得到证实，细胞内葡萄糖增高时，醛糖还原酶激活，促进山梨醇的生成，山梨醇的聚集导致细胞损伤，参与糖尿病微血管并发症的发生；糖尿病高血糖状态下多元醇途径的开放,生成山梨醇及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），NADH与血糖共同促进甘油二酯(DAG) 的生成，从而激活PKC；增加了磷酸丙糖浓度和甲基乙二醛（AGEs前体）合成，促进AGEs形成；过多的葡萄糖进入多元醇通路代谢，过度消耗还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，影响还原态谷胱甘肽(GSH)生成，减弱了抗氧化系统功能，加重氧化应激损伤。

    5 氨基己糖合成途径也是促进糖尿病并发症的主要因素。

    糖酵解途径中的代谢中产物堆积，使这些代谢物转向其他通路代谢。6-磷酸果糖在谷氨酰胺-6磷酸-酰氨转移酶的催化下进入氨基己糖代谢途径。己糖胺通路激活可以调节由高血糖诱导的基因转录的增加。过多的N－乙酰葡糖胺可与转录因子的丝氨酸、苏氨酸磷酸化位点结合，促进PAI-1、TGFβ的产生。同时还可以通过磷酸化作用对胞质蛋白进行修饰，影响蛋白功能。

    6 核因子-κB (NF-κB)是最早被发现的氧化应激敏感性转录因子之一。

    NF-κB可被广泛的内源性及外源性物质所激活，包括高血糖、游离脂肪酸的增加、ROS、TNF-α、IL-1、AGE-RAGE、p38MAPK、DNA损伤、病毒感染等。NF-κB 激活后在调节基因的表达、免疫及炎性反应、凋亡过程中起关键作用，调节的基因表达包括生长因子(VEGF等)、炎症因子(TNF-α,IL-1等)、RAGE、粘附因子等，其中部分基因产物再次激活NF-κB，构成正反馈途径。NF-κB 所调节的基因表达成分在糖尿病血管并发症的发生发展过程中都不同程度地起到促进作用。

    7 多聚(ADP核酸)聚合酶(PARP)的激活。

    高血糖诱导产生过多的自由基可直接导致DNA损伤。DNA损伤片段特异性激活细胞核中的DNA修复酶—PARP。PARP的激活使细胞内NAD+耗尽、糖酵解速率减慢、电子传递受阻、ATP缺乏。同时，GAPDH 分子的ADP-核糖多聚化，导致其活性受抑制，引起糖酵解上游代谢产物的堆积，激活不同的血管损伤通路，导致血管并发症发生。

    四、抗氧化治疗的应用

    机体存在广泛的内源性及外源性抗氧化系统，起到清除自由基、保护细胞功能的作用。目前抗氧化剂可分为主要的三大类：①抗氧化酶系：过氧化氢酶,谷胱甘肽还原酶，谷胱苷肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶等。②链阻滞抗氧化剂：又可分为脂溶性抗氧化剂(VitE ，VitA，黄酮类，辅酶Q10)和水溶性抗氧化剂(VitC，尿酸，血浆巯基蛋白，清蛋白，还原性谷胱甘肽)。③转运金属结合蛋白(转铁蛋白，铜蓝蛋白，乳铁蛋白)等。

    尽管糖尿病患者存在明显的氧化应激损伤，引起糖尿病并发症的发生已得到广泛的证实，但抗氧化治疗在糖尿病中的应用仍然是学者疑惑和关注的问题。糖尿病抗氧化治疗应该从病因学入手。如果能够阻断线粒体产生过多的ROS，则可能从根本上控制糖尿病血管病变的发生与发展。但传统的抗氧化剂只能清除部分已经形成的过氧化产物，难以达到理想疗效，有待开发新药。目前在大量基础和临床试验中研究较多的主要抗氧化剂包括以下几种：

    超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶这类低分子物质有类似天然SOD或过氧化氢酶的催化作用，可持续清除ROS，有效抑制氧化应激，取得理想的疗效。证实在STZ诱导的糖尿病鼠中，SOD能恢复血管内皮功能，改善神经内膜的血流及自主神经传导速度。

    L丙酰基-肉毒碱是细胞内过氧化物清除剂，可以改善线粒体功能，减少DNA 损伤，改善糖尿病心脏功能，周围神经功能以及血流状况。

    α-硫辛酸是具有自我再生能力的线粒体内抗氧化剂。硫辛酸能还原氧化型谷胱甘肽，对缓解高血糖引起的多元醇途径中过度消耗的GSH有再生循环作用，对VitC和VitE，以及其他辅酶具有再生循环作用，能延长普通抗氧化剂的寿命。硫辛酸自身具有强大的自由基清除作用，能清除多种ROS，提高机体抗氧化防御功能。在糖尿病动物模型及糖尿病患者中被证实可以改善血管内皮功能。

    LY333531、PJ34 及FP15 分别抑制β亚型PKC、PARP和过氧化硝酸盐的生成，改善高血糖导致的血管内皮细胞损伤。在小范围的研究及体外实验中证明VitE、VitC、β2胡萝卜素等抗氧化剂能阻断氧化应激途径。另外,目前应用于临床的噻唑烷二酮类(TZDs)药物、他汀类药物、血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)受体拮抗剂以及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)均具有一定程度的细胞内抗氧化作用。临床试验发现辛伐他汀可改善糖尿病视网膜病变，预防心血管事件的发生。ACEI与ATⅡ受体拮抗剂均可抑制高血糖所致的氧化应激，阻止硝基酪氨酸在肾脏中沉积,延缓蛋白尿的发生。由于糖尿病血管病变机制复杂，影响因素较多，疗程、剂量及终点时抗氧化复合物的作用位点也影响抗氧化治疗的疗效，抗氧化治疗仍有待于进一步研究。

    综上所述，氧化应激在糖尿病血管损伤的发病机制中起重要作用。糖尿病状态下产生大量ROS，是导致血管损伤的多条通道激活的共同途径，是糖尿病血管并发症产生的始动因素。针对细胞内氧化应激的治疗措施以及新药研发可能从根本上预防和控制糖尿病血管并发症的发生发展。