摘要：
[目的]研究单核细胞趋化蛋白-1和核因子-KB与巨噬细胞浸润、冠状动脉粥样硬化宽块形成及冠状动脉进行性狭窄的关系。
[方法]从39例尸检标本中获得39个冠状动脉左前降支粥样硬化的标本。应用弹力纤维染色及电脑软件分析系统，测量其狭窄程度，并根据其狭窄程度将其分为3组(A组：<50％；B组：50％～75％；C组：>75％)。B组与C组中又根据粥样斑块占内膜面积的百分比分别以20％和30％为界，分为两个亚组，即B1(<20％)、B2(≥20％)和C1(<30％)、C2(≥30％)。用免疫组织化学的方法来检测巨噬细胞(CD68)，单核细胞趋化蛋白一1和核因子一KB在冠状动脉宽块中的表达情况。
[结果]①B组与c组的中膜巨噬细胞浸润的个数(6.38±7.68。6.09±4.95)明显高于A组(0.78±0.67)，P<0.05。B2和C2的宽块面积占内膜面积的百分比(42.94±6.54，67.20±15.63)和巨噬细胞数(189.17±78.92，195±71．93)明显高于B1(16.74±3.18，5.20 ±27.52)和Cl(16.84±4.89，110±13.60)，P<0.05。②MCP-1和NF-KB的阳性表达出现在粥样宽块处的内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞，尤以在泡沫细胞处更加明显；而且两者之间存在显著正相关(r=0.632，P<0.001)。
[结论]动脉局部核因子-KB和MCP-1的过度表达可能参与并调节局部炎症反应及巨噬细胞的浸润，而且与冠状动脉粥样硬化斑块形成及管腔进行性狭窄关系密切。
冠状动脉粥样硬化是冠心病最常见的原因。大量研究表明，炎症反应对动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成起着关键性的作用，尤其是单核巨噬细胞系统，在粥样斑块的形成、发展及破裂的过程中都起到重要的作用。因此，研究与炎症反应有关的各种因子，特别是与单核巨噬细胞浸润有关的因子，对于了解动脉粥样硬化的形成是至关重要的。核因子-kappa(nuclearfactor-kappa B，NF-KB)是调节基因转录的关键性因子，并参与了许多与炎症反应有关的基因的表达调控。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是一种趋化因子，在AS的发生与发展过程中都起到重要的作用。有研究发现它的表达与NF—KB有着密切的关系。有关动物实验表明国产红葡萄酒可显著抑制食饵性AS时所致的NF—KB的活化，并下调MCP-ImRNA的表达 。但国内尚未见应用人体冠状动脉粥样硬化的标本来研究两者的表达情况及其相关性的报道。本研究通过应用组织形态测量分析，组织化学染色和免疫组织化学检测等方法，选取人冠状动脉粥样硬化的标本，研究NF-KB和MCP-1与单核巨噬细胞浸润、粥样斑块的形成以及血管管腔进行性狭窄的关系，以及两者的相关性。从而为临床研究如何预防和治疗冠状动脉粥样斑块的形成及血管管腔狭窄提供一个新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料
39例2001～2004年尸检冠状动脉左前降支动脉粥样硬化(选取非动脉分支处，垂直于冠状动脉长轴)的蜡块标本，年龄为21～77岁，平均年龄51.8岁。
1.2 常规病理学检查及分组
1.2.1 切片及染色：选定标本经常规10％福尔马林固定、脱水、透明、石蜡包埋及切片。进行HE及弹力纤维染色。部分切片水化后进行免疫组织化学染色。
1.2.2 组织形态测量：弹力纤维染色切片用于血管的组织形态测量，通过NIH Scion Image(60.1)软件系统，分别测量出血管内、外弹性膜周长，内腔面周长，以及粥样斑块周长。根据其测量结果，分别计算出：血管截面积、血管中膜面积、血管内膜面积及内膜粥样斑块面积。正常血管内膜由单层内皮细胞及其下的内弹性膜构成。本研究以内弹性膜周长构成的面积为正常血管内腔面积，计算血管的狭窄程度。
1.2.3 分组：根据血管的狭窄程度将其分为三组：即A组(<50％)，B组(50％～75％)，C组(>75％)。
1.3 免疫组织化学检测
1.3.1 试剂：鼠抗人平滑肌细胞a-actin单克隆抗体，鼠抗人单核巨噬细胞CD-68单克隆抗体，均购自福州迈新生物技术开发公司；鼠抗人NF-KB p65单克隆抗体，羊抗人MCP一1多克隆抗体，均购自北京中山生物技术有限公司。SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司(用于 a-actin，CD-68，NF-KBp65的检测)，MCP-1的二抗为辣根酶标记的兔抗山羊IgG购自于北京中山生物技术有限公司。前两种抗体为即用型，NF-KBp65和MCP-1均为浓缩型，其工作液浓度分别为1：50和1：100。
1.3.2 步骤：采用sP法，石蜡切片脱蜡和水化后，3％H2O2一甲醇消化内源性过氧化物酶的活性，修复抗原(NF和MCP-1采用煮沸热修复，CD68采用胰酶修复)，0．5％小牛血清白蛋白封闭非特异性抗体，滴加一抗。滴加生物素化的二抗，滴加链霉菌抗生物素蛋白——过氧化酶，DAB显色，水洗。苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。显微镜下观察结果。
1.3.3 结果判定
(1)平滑肌细胞密度：依据SMCa-actin染色，随机选择4个不同视野下(×400)的区域。分别计数血管内膜和中膜的平滑肌细胞数。两人分别计数取其均值，即为该血管内膜或中膜的平滑肌细胞密度。
(2)巨噬细胞密度：依据CD68染色，分别计数血管截面的内膜、中膜及外膜的巨噬细胞数。两人分别计数取其均值，即为该血管内膜、中膜及外膜的巨噬细胞密度。
(3)NF-KB和MCP-1的阳性结果判定：参照许良中 等的免疫组织化学反应结果的判定标准，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判断结果。根据切片中阳性细胞占计数细胞百分比分为4级：≤5％ 为0分；6％～25％ 为1分；26％～50％为2分；≥51％为3分。根据显色程度判断阳性强度：基本不着色者为0分；着色淡黄色者为1分；棕黄色者为2分；棕褐色者为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘，为其最后得分。0～1为阴性(-)；2～3分为弱阳性(+)；4～6分为中等阳性(++)；6分以上为强阳性(+++)。
1.4 统计学分析
应用SPSS10.0统计软件中的t检验、秩和检验、非参数等级相关性(SpeamaII)检验。三组间比较用One-WayANOVA检验。用Bonferroni方法进行两两比较。P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 内膜增厚与冠状动脉狭窄
组织学观察及测量结果显示所检测的冠状动脉血管外径基本一致，且血管中膜面积基本相同，然而血管内膜面积及血管内径显示三组间存在有显著性差异(P<0.001，表1)。此结果表明，血管内膜的增厚是导致血管狭窄的主要原因。
表1 三组的组织病理学改变 (x±s)
|
|
A组 |
B组 |
C组 |
|
狭窄程度（％） |
40.22±6.941） |
62.46±4.85 2） |
83.3±5.78 |
|
血管内直径（mm） |
3.83±0.37 3） |
3.61±0.55 3） |
2.62±0.74 |
|
血管外直径（mm） |
5.17±0.54 |
5.61±0.79 |
5.50±0.95 |
|
内膜面积（mm2） |
5.55±1.80 1） |
11.85±4.55 |
15.41±6.34 |
|
中膜面积（mm2） |
4.79±1.09 |
4.65±0.70 |
4.19±2.04 |
|
内膜/中膜面积（％） |
1.19±0.42 1） |
2.54±0.81 4） |
4.06±1.82 |
|
中膜SMC密度 |
106.00±41.68 1） |
77.0±18.49 |
71.0±19.99 |
|
中膜巨噬细胞密度 |
0.78±0.67 1） |
6.38±7.68 |
6.09±4.95 | 1)A组和B组和C组相比，P<0.01；2)B组与C组相比，P<0.001；3)A组、B组分别与C组比较，P<0.001；4)B组与C组比较，P<0.001
2.2 内膜粥样斑块形成与内膜增厚的关系
粥样斑块出现于狭窄程度>50％ 的冠状动脉中(B组、C组)。同时B、C两组中粥样斑块面积占内膜面积的比例各异。以其所占内膜面积是否>20％和30％为界。将它们分为两组亚群B1、B2；C1、C2(表2)。
2.3 血管平滑肌细胞密度与冠状动脉狭窄
中膜平滑肌细胞密度随内膜增厚而逐渐减少；而内膜非粥样斑块区域中膜平滑肌细胞密度基本一致，极少有平滑肌细胞出现于粥样斑块区域(表1。图1)。A组的平滑肌细胞密度与B组和C组存在显著性差异(P<0.01)。
表2 各亚组中的平均斑块面积占内膜面积(x±s）
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组别 |
平均斑块面积占内膜面积的百分率％ |
P |
|
B1组 |
16.74±3.18 |
|
|
B2组 |
42.94±6.54 |
0.000 1） |
|
C1组 |
16.84±4.89 |
|
|
C2组 |
67.20±15.63 |
0.000 2） | 1)B2组与B1组比较；2)C2组与C1组比较B2亚组的百分率明显大于B1亚组。P<0.001；C2亚组的百分率明显大于C1亚组．P<0.001
图1 a-actin在内膜殛中膜SMC中的表达情况×100
图2 CD-68在内膜巨噬细胞殛泡沫细胞中的表达情况×400
2.4 巨嘴细胞浸润与冠状动脉内膜中粥样斑块形成
免疫组织化学染色显示：CD68阳性细胞广泛存在于冠状动脉的外膜、中膜及内膜（图2)。外膜巨噬细咆浸润无明显差异 B组及C组中中膜内巨噬细胞提润明显大于A组(P<0.01)(表1)，提示中膜巨嚆细胞的浸澜参与了血管中膜的平滑肌细胞的代谢和生存。内膜中巨噬细胞浸润与内膜增厚及粥样斑块形成相并行 特别是B、C组的不同亚组中，内膜的巨噬细胞浸润呈显著性差异(P<0.05)（表3)，说明在斑块越太的亚组中巨嘴细胞浸润的数日越多。
表3 各亚组内胰巨噬细胞的密度 （x±s）
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组别 |
内膜巨噬细胞 |
P |
|
B1组 |
5.20±27.52 |
|
|
B2组 |
189.17±78.92 |
0.02 1） |
|
C1组 |
110±13.60 |
|
|
C2组 |
195±71.93 |
0.04 2） | 1)B2组与B1组比较，P<0 05；2)C2组与C1组比较，P<0.05
2.5 NF-KB和MCP-I在局部血管组织中的表达及相关性
免疫组织化学检测显示NF-KB和MCP-1阳性反应主要存在于血管内膜区域，在内皮细胞、内膜平滑肌细胞受巨噬细胞中表达(图3、4) 两者在内膜的表达强度均为C组>B组>A组(表4、5)。
图3 NF-KB在斑块处的表达情况×400
图4 MCI-I在斑块处的表达情况×400
表4 NF—KI在各组中的表达
|
组别 |
例数 |
阳性细胞表达强度
－ ＋ ＋＋ ＋＋＋ |
P |
|
A组 |
10 |
5 3 2 0 |
|
|
B组 |
18 |
3 3 12 1 |
0.012 1） |
|
C组 |
11 |
0 0 6 5 |
0.000 1） 0.005 2） | 1)与A组比较；2)与B组比较
如表4所示，在39例AS中，NF-KB在31例中有表达(+～+++)，其阳陛率为79.5％(31／39) 其中A组阳性率50％(5／10)，B组阳性率83.3％(15／18)，C组阳性率100％ (11／11)。在各组中，NF-KB的表达均存在显著性差异，A组与B组比较，P<0.05．B组与C组比较，P<0.01，A组与c组比较，P<0.001。
表5 MCP-I在各组中的表达
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组别 |
例数 |
阳性细胞表达强度
－ ＋ ＋＋ ＋＋＋ |
P |
|
A组 |
10 |
8 2 0 0 |
|
|
B组 |
18 |
6 1 11 0 |
0.01 1） |
|
C组 |
11 |
0 0 9 2 |
0.000 1） 0.006 2） | 1)与A组比较；2)与B组比较
如表5所示，在39例As中，MCP-1在26例中有表达(+～+++)，其阳性率为64.1％(25／39)：其中A组附性率20％ (2／10)．B组阳性率66.7％(12／18)，C组阳性率100％(11／11)。在各组中，MCP-l的表达均存在显著性差异，A组与B组比较，P<0.05，B组与C组比较，P<0.01，A组与C组比较，P<0.001。
用spearsman等级相关性检验发现NF-KB的表达与MCP-1的表达呈显著正相关(r=0.632，P<0.001)(表6)。
表6 NF-KB与MCP-1表达的相关性
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MCP -l |
NF-KB
- + ++ +++ |
Total(％) |
|
- |
6 3 4 1 |
14(35.9) |
|
+ |
0 l 2 0 |
3 (7.7) |
|
++ |
2 l 14 3 |
20 (51.3) |
|
+++ |
0 0 0 2 |
2(5.1) |
|
Total(％) |
8(20.5) 5(12.8) 2o(51.3) 6(15.4) |
39 | r=0.632．P <0.001
3 讨论
本实验通过对尸检标本的冠状动脉左前降支的蜡块标本的研究，对造成冠状动脉粥样硬化斑块的形成及其管腔进行性狭窄的一些因素有了进一步的认识。
本实验通过对不同狭窄程度的冠状动脉的研究发现，血管的狭窄主要是与内膜的增厚有关。既往的研究曾提出内膜的增厚不仅与斑块的大小有关，而且与中膜的平滑肌细胞的迁入和增殖有关。作者研究发现在三组内膜中均有平滑肌细胞的出现，在内膜非粥样斑块区域平滑肌细胞密度基本一致，极少的平滑肌细胞出现于粥样斑块区域，说明平滑肌细胞的迁入和增殖在内膜的增厚过成中并不占主导地位。同时，本研究还发现粥样斑块的面积占内膜面积的百分比三组间明显不同。B组和C组明显大于A组，此结果说明粥样斑块的形成是导致内膜增厚的主要原因，也是导致血管管腔进行性狭窄的主要根源。
有研究证明巨噬细胞在粥样斑块的构成、发展和破裂的过程中起到重要的作用，其可以导致急性冠脉综合征。本实验研究发现在不同狭窄程度的冠状动脉的管壁中巨噬细胞的浸润明显不同。B组和C组的巨噬细胞浸润明显高于A组，而在B组和C组又尤以B2亚组和C2亚组为多。在粥样斑块面积越大的部位巨噬细胞的含量亦越高。此结果说明巨噬细胞的浸润直接或间接参与了粥样斑块的形成及血管的狭窄。MCP-l作为一种趋化因子，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润，而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖，对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用 。本次实验研究中，作者应用免疫组织化学技术检测了冠状动脉粥样硬化中MCP-1的表达情况。发现在B组和C组中巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞中都有MCP-1的表达，尤其是在巨噬细胞(主要是泡沫细胞)聚集处表达最明显。提示MCP-1在巨噬细胞浸润及粥样斑块形成过程中起到了重要的作用。
NF-KB作为一种炎症反应的调节因子，长时间以来一直被认为是一种重要的致动脉粥样硬化发生的因子，主要是由于它对一些致动脉粥样硬化的炎症基因的调节作用，包括介导炎症反应的细胞因子如TNF-a、IL-6等；细胞黏附分子如VCAM-1、ICAM-1等；趋化因子如MCP-1、IL-8等等。同时有研究证实，阻断NF-KB的表达能显著抑制炎症相关因子的产生。本实验中，作者检测了NF-KB在冠状动脉粥样硬化病变处的表达，发现NF-KB主要表达于斑块处的巨噬细胞(主要是泡沫细胞)、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的细胞浆(强阳性者在细胞核也有表达)，尤以在巨噬细胞和泡沫细胞处表达最为明显，说明NF-KB在巨噬细胞浸润及粥样斑块形成的过程中也起到了重要的作用。同时发现。NF-KB的表达和MCP-l的表达在动脉粥样斑块的形成过程中具有显著的正相关。从而推测NF-KB作为一种重要的调节细胞基因转录的因子，调节了MCP-l的表达。同时MCP-l诱导了巨噬细胞浸润到粥样斑块处，以粥样斑块处巨噬细胞计数明显升高，以及MCP-1染色明显呈阳性反应为其佐证。从而促进了粥样斑块的形成，导致了冠状动脉进行性的狭窄。
希望通过本实验的研究，为临床研究如何预防和治疗冠状动脉粥样斑块的形成及血管进行性狭窄提供一个新的思路。
 单核细胞趋化蛋白-1和核因子-KB与巨噬细胞浸润及动脉粥样硬化斑块形成的关系 |
