【摘要】
目的 探讨血清中抗氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）抗体、抗β2糖蛋白I（β2GPI）抗体及抗内皮细胞抗体（AECA）3种自身抗体与动脉粥样硬化的关系。
方法 分别用酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光法（IIF）检测118例冠状动脉硬化性心脏病患者及44名健康对照者血清中3种自身抗体水平。
结果 冠心病组血清抗ox-LDL抗体阳性率为32.20%，明显高于健康对照组阳性率6.82%(P=0.001);抗β2GPI抗体阳性率为31.36%，其健康对照组阳性率为11.36%（P=0.009）；血清抗内皮细胞抗体阳性率冠心病组为38.14%，健康对照组为13.64%（P=0.002）。在血脂正常的冠心病组中抗ox-LDL和抗β2GPI抗体阳性率也高于健康对照组。
结论 血清中上述3种自身抗体阳性率与动脉粥样硬化密切相关，抗ox-LDL和抗β2GPI抗体阳性率与血脂无明显相关性，自身免疫反应是动脉粥样硬化的一种可能的发病机制。
【关键词】冠状动脉硬化；自身抗体
Detection of the positive rates of serum autoantibodies associated with atherosclerosis and its clinical significance
GENG Hong-lian,TU Xiao-qing,ZHU Ye, CHEN Jun,GU Peng-fei,FAN Lie-ying,ZHONG Ren-qian.Department of Laboratory Diagnosis,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China
Corresponding author:ZHONG Ren-qian
【Abstract】
Objectives To explore the relationship between the positive rates of serum anti-ox-LDL,anti-β2GPI, anti-endothelial cell autoantibodies(AECA)and atherosclerosis.
Methods The levels of serum anti-ox-LDL and anti-β2GPI antibodies were measured by ELISA. The serum AECA was assayed by indirect immunofluorescence(IIF) in 118 patients with coronary arteriosclerosis disease(CAD)and 44 controls without CAD.
Results The positive rates of serum anti-ox-LDL、anti-β2GPI and AECA in CAD group were significantly higher than that in control.(30.20% versus 6.82%,P=0.001;31.36% versus 11.36%,P=0.009;38.14% versus 13.64%,P=0.002,respectively);In addition,the positive rates of serum anti-oxLDL and anti-β2GPI were higher in CAD patients with normal level of plasma lipids than that in control.
Conclusions The positive rates of serum anti-oxLDL、anti-β2GPI and AECA are related to atherosclerosis.Autoimmune reaction might play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis.
【Key words】Coronary arterisclerosis;Autoantibodies
动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）及其引起的心绞痛、心肌梗死和脑梗死等疾病严重危害人类健康，其发病率和死亡率居高不下，主要是因为该病的病原学和发病机制尚未阐明，因而缺乏早期实验室诊断指标和有效的治疗手段。近年来有研究认为自身免疫应答参与As的发生发展，并有相关报道证实：（1）在试验动物及人类动脉粥样硬化病灶处检测到氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、β2糖蛋白（β2-glycoprotein I、β2GPI）等自身抗原。（2）患者血清中抗ox-LDL、β2GPI的自身抗体滴度与As发生发展密切相关。（3）动物试验表明，用上述自身抗原来免疫动物，会影响As进展。我们主要探讨血清中抗-ox-LDL、β2GPI自身抗体和抗内皮细胞抗体（AECA）阳性率与冠状动脉硬化性心脏病（CAD）的相关性，进一步了解自身免疫反应在动脉粥样硬化发病中的作用。
对象和方法
1.对象：CAD组：2002年4月～11月本院心内科住院病人，共入选118例经临床诊断为CAD的患者，其诊断根据典型的临床表现、心肮酶学、心电图、并有61例经冠状动脉造影证实。其中男82例，女36例，平均年龄（65±9）岁。正常对照组：共入选44名健康体验者，无既往冠心病史，血脂、肝肾功能均正常，无其他自身免疫性疾病表现，其中男28例，女16例，平均年龄（59±7）岁。以上入选者均空腹采集静脉血，离心后取血清，-20℃冻存备用。
2.抗ox-LDL抗体的检测：抗ox-LDL抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自奥地利Biomedica公司，采用ELISA测定，酶标板包被的ox-LDL为Cu2+氧化LDL所得。操作严格按照说明书进行，血清起始稀释度为1∶50，每个测定板均同时测定6个标准品，其抗体含量依次为37、75、150、300、600、1200mU/ml，根据标准品的吸光度（A）值做出1条标准曲线，可将待测血清A值换算成含量值。
3.抗β2GPI抗体检测：抗β2-GPI抗体ELISA检测试剂盒购自英国Genesis公司，采用ELISA测定，酶标板包被有β2糖蛋白I。6个标准品抗体含量依次为0、5、10、25、50、100U/ml。血清起始稀释度过1∶50，加终止液后，450/620nm波长处酶标仪测A值，据标准曲线换算成含量值。
4.抗内皮细胞抗体检测：间接免疫荧光法检测抗内皮抗体的试剂盒购自德国Euroimmun公司（Genesis,Cambnid-eshire,UK），抗原基质为人脐静脉内皮细胞和灵长类肺组织，第二抗体为FITC标记的抗人IgG抗体。血清起始稀释度为1∶10，甘油封片后，荧光显微镜镜检。阳性血清在人脐静脉内皮细胞中表现为细胞浆的颗粒型荧光，在肺组织切片中表现为血管内皮的特征性荧光。
5.血脂的测定：采用BECKMAN CX4全自动生化分析仪，试剂为日本和光公司产品。按生化常规测定入选患者血脂水平，包括酶法测定总胆固醇（Tc）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），抗体阻碍法测定高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），免疫比浊法测定脂蛋白（a）。
6.统计学分析：对照组抗ox-LDL抗体和抗β2GPI抗体含量以 ±s表示，CAD组大于对照组 ±2s为阳性，3种自身抗体测定结果均用阳性率表示。采用t检验方法，运用SPSS10.0软件进行统计分析。
结果
1.3种自身抗体检测结果：对照组抗ox-LDL抗体水平（197.15±61.67）U/L，CAD组以大于320.48U/L为阳性；抗β2GPI抗体以大于5.26U/ml为阳性；AECA以人脐静脉内皮细胞细胞质的颗粒型荧光为阳性判断标准。3种自身抗体检测结果如表1所示。由表1可以看出CAD组3种自身抗体阳性率均高于对照组，自身抗体阳性率均高于对照组，其差异有显著意义（P<0.01）；3种自身抗体特异性均较高而灵敏度一般；SPSS10.0软件进行两样本率的比较分析发现，CAD组男性与女性之间3种自身抗体阳性率差异无显著意义（P>0.05）。
2.血脂检测结果；118例CAD患者血脂检测结果，包括总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C和脂蛋白（a）等项目，均在正常参考值范围内的即为CAD血脂正常者，共有32例；上述指标有任何一项超出正常参考值范围者，即为CAD血脂异常组。健康对照组血脂均为正常。表2对CAD血脂正常组与对照组3种自身抗体的阳性率进行了比较。结果显示，抗ox-LDL抗体和抗β2GPI抗体在CAD血脂正常组阳性率仍高于对照组，其差异有显著意义（P<0.05），AECA阳性率在两组之间的差异无显著意义（P>0.05）。
表1 3种自身抗体在CAD组和对照组的检测结果
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抗体 |
CAD组(n＝118) |
对照组(n＝44) |
P值 |
Se(%) |
Sp(%) |
PV+(%) |
PV-(%) |
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阳性例数 |
阳性率(%) |
阳性例数 |
阳性率(%) |
|
抗－ox－LDL |
38 |
32.20 |
3 |
6.82 |
0.001 |
32.20 |
93.18 |
92.68 |
33.88 |
|
抗-β2GPI |
37 |
31.36 |
5 |
11.31 |
0.009 |
31.36 |
88.64 |
88.10 |
32.50 |
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AECA |
45 |
38.14 |
6 |
13.64 |
0.002 |
38.14 |
86.36 |
88.24 |
34.23 |
注Se：灵敏度；Sp特异性；PV+：阳性预测值；PV－：阴性预测值
表2 CAD血脂正常组与对照组
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抗体 |
CAD组（n=118） |
对照组(n＝44) |
P值 |
|
阳性例数 |
阳性率(%) |
阳性例数 |
阳性率(%) |
|
抗－ox－LDL |
8 |
25.00 |
3 |
6.82 |
0.045 |
|
抗-β2GPI |
11 |
34.38 |
5 |
11.31 |
0.022 |
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AECA |
9 |
28.13 |
6 |
13.64 |
0.149 |
讨论
本研究主要探讨了抗ox-LDL、抗β2GPI和AECA3种自身抗体与CAD的关系。试验结果表明这3种抗体在CAD组阳性率均显著高于对照组（P<0.05），且CAD血脂正常组抗ox-LDL和抗β2GPI抗体阳性率仍高于对照组（P<0.05），而在CAD组男女性之间抗体阳性率差异无显著意义（P>0.05）。结果提示CAD患者血清中确实有自身抗体水平升高，且其阳性率不依赖于血脂的高低。统计分析提示，虽然3种自身抗体的灵敏度不算高，但其特异性均较高，CAD患者血清中上述自身抗体的检测，有可能作为动脉样硬化症的辅助诊断指标。
动脉粥样硬化是多因素所致疾病，以前认为的吸烟、高血压、高血脂、糖尿病等危险因子已不足以解释As的发生发展。近年来国外有研究认为自身免疫因素与As的发病相关，并有相关自身抗体的研究报道，本研究所检测的抗ox-LDL、抗β2GPI和AECA是其中备受关注的几种自身抗体。LDL在体内经氧化修饰成为ox-LDL，形成特异性氧化表位，具有很强的免疫原性，能刺激体内免疫系统产生抗ox-LDL的自身抗体，以IgG和IgM型最为常见。George等收集整理了一些经血管造影证实为冠心病患者的数据资料，包括传统危险因子、感染相关性、免疫和自身免疫等方面，并在此基础上建立了一个统计学模型。发现除了25个不同的检测参数外（包括传统危险因子如高血压、高脂血症和糖尿病等），预测冠状动脉粥样硬化涉及范围最好的指标是抗ox-LDL抗体滴度。本研究结果显示，在与As相关的3种自身抗体中，抗ox-LDL抗体的特异性（93.18%）是最高的。β2GPI在人类动脉粥样斑块的内皮下层大量表达，在体外，内皮细胞与抗β2GPI抗体共同培养，可使内皮细胞表达黏附分子增加，包括E-选择素，VACM-1和ICAM-1等。β2GPI介导的体液免疫反应能够激活内皮细胞，刺激其自身黏附分子表达，吸引白细胞浸润，引起局部免疫炎症反应，造成血管内皮损伤，在As形成早期起重要作用。
β2GPI特异性CD4+T淋巴细胞分泌的IL-6作为一种B细胞活化因子，能够促进抗β2GPI抗体的产生。本研究表明抗β2GPI抗体在CAD组阳性率（31.36%）显著高于对照组（11.31%,P=0.009）。AECA可与血管内皮细胞（EC）结合，改变EC的功能，或通过补体依赖及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用破坏EC，加重As患者血管的损伤。国外报道和本研究均证实CAD患者血清中抗ox-LDL、抗β2GPI和AECA 3种自身抗体阳性率显著高于对照组，自身免疫应答致动脉粥样硬化的作用不容忽视，免疫调节在As防治中的作用也越来越受到人们的关注。但是这些自身抗体的出现，究竟是促进还是抑制As的发展？或者仅仅是自身抗原存在的一种附带反应？这些自身抗体的检测能否作为As辅助诊断和判断预后的指标？这些尚争定论的问题仍需进一步研究探索。
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