【摘要】 目的 探讨大蒜素对动脉粥样硬化模型小鼠血脂代谢以及动脉粥样硬化发展的影响。方法 小鼠分6组, 分别为普通饮食组(G1、G2组) 、高脂高胆固醇组(G3、G4组) 和高脂高胆固醇/高糖组(G5、G6组)，其中偶数组同时给予大蒜素灌胃处理。分别于小鼠3、5、7、11 和15 周龄，检测血清总胆固醇(TC) 、甘油三酯(TG) 、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)( n = 6) , 并同时取小鼠肝脏及主动脉进行形态学观察( n = 6)。结果 高脂高胆固醇以及高脂高胆固醇/ 高糖喂养组小鼠较同龄普通饮食喂养组小鼠的血脂TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平明显增高, 大蒜素处理组除HDL-C 外, 其他血生化指标均有不同程度的降低(如TC，G2 /G1，42140 ±2157 vs. 45140 ±6172；G4/G3，106190 ±5137 vs. 109120 ±2135；G6/G5，115145 ±1127 vs. 121176 ± 5112) 。大蒜素处理组小鼠肝脏和主动脉内膜病理学改变相对较轻。结论 大蒜素对于动脉粥样硬化模型小鼠的TC、TG、LDL-C 水平均有一定程度的降低作用，而对HDL-C 没有明显影响。对肝脏脂肪沉积以及主动脉动脉粥样硬化病变的发展均有一定程度的抑制作用。
 
    动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见的多基因疾病。脂质代谢异常、肥胖、糖尿病等诸多因素与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。临床及动物实验显示，血脂代谢异常导致的动脉内膜损伤、脂质沉积是动脉粥样硬化的重要始动原因。血浆总胆固醇(TC) 和甘油三酯(TG) 增高等血脂代谢紊乱以及脂质氧化是引起动脉内皮损伤的重要原因之一[ 1-3 ] 。

    肥胖作为心脑血管疾病危险因子, 常与其他致病因素并存，共同参与多种相关疾病的发生发展。瘦素受体(leptin receptor，LR) 介导瘦素参与糖、脂肪等能量代谢。LR 编码基因(db) 突变(Leprdb/db)小鼠表现为皮下及内脏周围脂肪过度沉积，个体高度肥胖并伴有血脂、血糖代谢失衡[4,5]，说明瘦素及其受体功能异常与肥胖及其相关病变有关。目前中国有2 亿人超重、7000 万人肥胖，高血压和高血脂的人数超过1. 6 亿，冠心病、中风等心血管疾病患者呈急速增长趋势。

    数千年来在中国等亚洲国家，大蒜一直是一种药食两用的食品。20 世纪70 年代以来国内外对大蒜药用价值的研究和应用越发重视。现代医学研究也说明大蒜和天然大蒜制剂具有良好的防病治病功效，其药理作用价值受到人们的关注，成为欧美等国用于抗菌、提高免疫力、调节血脂和抗肿瘤的首选天然药物之一。然而，应用脂代谢关键基因突变小鼠模型, 开展大蒜素对其血脂代谢紊乱影响以及抗动脉粥样硬化的研究不多，为此在前期工作的基础上，我们利用三基因突变小鼠模型，探讨了大蒜素对其血脂代谢影响的作用特点，为进一步开展相关研究，提供了有价值的实验数据。

    材料与方法

    一、小鼠

    利用apoE-/-，LDLR-/- 和Leprdb/db 单基因突变小鼠( 美国Jackson 实验室)，于本实验室杂交培育建立三基因突变小鼠模型(ALO)。雄性小鼠于出生后第4 周停止母乳喂养，随机分成6 组。在不同喂养条件，即普通饲料(含4% 动物脂肪和0.075%胆固醇)、高脂高胆固醇饲料(含10% 动物脂肪和1.25% 胆固醇) 以及高脂高胆固醇饲料加20% 蔗糖饮水饲养的同时，分别添加安慰剂和大蒜素溶液灌胃(表1) 。三基因突变小鼠由山东师范大学山东省“动物抗性生物学”重点实验室SPF 级动物房饲养、繁殖，恒温、恒湿、12h 明暗循环照明，饮水和饲料均令其自由摄取。大蒜素为自备的大蒜乙醇萃取液，与Sigma 标准品比较，大蒜素纯度为95% 以上。

   表1 ALO 小鼠分组及不同饮食喂养情况

喂养情况	G1	G2	G3	G4	G5	G6
饲料	普通	普通	高脂高胆固醇	高脂高胆固醇	高脂高胆固醇	高脂高胆固醇
饮水	自来水	自来水	自来水	自来水	20% 蔗糖水	20% 蔗糖水
灌胃处理	生理盐水	大蒜素液	生理盐水	大蒜素液	生理盐水	大蒜素液
小鼠总数	30 只	30 只	30 只	30 只	30 只	30 只

    注：设定3，5，7，11 和15 周龄5 个年龄段，每个年龄段每组设6 只小鼠，分别用于血生化和肝脏、主动脉形态检测

    二、大蒜素给药方式

    于小鼠出生后第4 至第15 周龄连续12 周，2次/d，每天早晚9 点各灌胃给药一次；每次每只小鼠给药量为10 mg/kg。

    三、血生化指标检测

    分别解剖3、5、7 、11 和15 周龄小鼠( n = 6)，采集静脉血，分离血清，分别采用COD - PAP、GPO -PAP 法和免疫抑制酶试剂直接法，测定TC、TG、HDL- C 和LDL - C 浓度。

    四、肝脏及主动脉形态学观察

    分别制备各组不同年龄段小鼠肝脏和主动脉根部冰冻切片( 5 μm) ，油红O和HE 染色，光学显微镜下拍照记录。

    五、统计学分析

    实验数据以均数±标准差( x ±s) 表示，应用SPSS11. 0 统计软件进行分析。实验结果采用独立样本的t 检验，P>0.05 为差异无显著性，P<0.05为差异有显著性，P<0.01 为差异有非常显著性。

    结 果

    一、血脂水平变化

    各组小鼠随周龄增长，血脂水平均有不同程度的增加，其中高脂高胆固醇饮食喂养组小鼠的TC水平均显著高于同龄普通饮食喂养组(P<0.01)，而高脂高胆固醇加高糖喂养组小鼠比单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠高(P<0.05)(表2)。大蒜素处理组小鼠其TC 水平比相同饮食非大蒜素处理组小鼠低，但差异无显著性(P<0.05)。随年龄增长，两组间的TC 水平差值幅度有所增大。

    各组小鼠的TG 水平在普通饮食、高脂高胆固醇以及高脂高胆固醇加高糖饮食喂养条件下依次增加。在同一年龄段，相同饮食条件的两组对比，TG水平在大蒜素给药组没有明显变化(P<0.05)(表2)。

    LDL-C、HDL-C 水平的变化情况与TC 相似，在普通饮食、高脂高胆固醇、高脂高胆固醇/高糖饮食3 个喂养条件下依次增加，并都随着小鼠周龄的增长，至11 周龄大小时其HDL-C、LDL-C 水平开始趋于稳定。辅以大蒜素给药处理后，同一年龄段相同饮食喂养的小鼠LDL-C 水平有一定程度的降低(P<0.05)。而HDL-C 水平在大蒜素给药处理后，相同饮食的小鼠间无明显变化(表2) 。

    表 2 6 组小鼠血脂水平变化情况( 珋x ±s)

生化指标	G1	G2	G3	G4	G5	G6
3 周 ( n =6 )
TC ( mM/L)	22162 ±1127	22148 ±1103	22136 ±1107	22165 ±0164	22156 ±1174	22128 ±1137
TG ( mM/L)	1148 ±0145	1145 ±0126	1142 ±0135	1124 ±0155	1131 ±0117	1138 ±0148
LDL ( mM/L)	3121 ±0165	3147 ±1137	4109 ±2179	3116 ±0128	3129 ±0131	2190 ±0128
HDL ( mM/L)	3124 ±0123	3145 ±0136	3113 ±1165	3123 ±0154	3144 ±0128	3128 ±0165
5 周 ( n =6 )
TC ( mM/L)	34160 ±4138	36120 ±8199	87135 ±5106	85126 ±0183	87134 ±7136	78152 ±9103
TG ( mM/L)	1167 ±0132	1157 ±0117	3114 ±0152	3101 ±0163	3134 ±0125	3124 ±0173
LDL ( mM/L)	20160 ±2153	20180 ±5113	34154 ±6142	38170 ±4132	66134 ±1156	63160 ±5128
HDL ( mM/L)	4122 ±0154	4134 ±5154	7147 ±1123	8123 ±0178	14113 ±1165	15145 ±0125
7 周 ( n =6 )
TC ( mM/L)	54113 ±9177	49120 ±5176	112180 ±3124	106167 ±1172	135167 ±1135	129134 ±2153
TG ( mM/L)	1174 ±0111	1161 ±0158	3156 ±0127	3119 ±0123	4110 ±0138	4123 ±0145
LDL ( mM/L)	23170 ±1198	23140 ±4132	77100 ±6117	62170 ±8107	72173 ±5174	71167 ±4123
HDL ( mM/L)	4195 ±1185	5167 ±1152	12156 ±1126	13168 ±1104	16156 ±0125	17149 ±0148
11 周 ( n = 6)
TC ( mM/L)	53110 ±4116	49110 ±7198	110140 ±3123	103180 ±4161	128150 ±2144	120100 ±3114
TG ( mM/L)	1195 ±0152	1188 ±0123	3156 ±0142	3128 ±0137	4127 ±0119	4138 ±0161
LDL ( mM/L)	20162 ±5113	20111 ±3125	68198 ±4107	66140 ±6192	58145 ±8126	54167 ±3122
HDL ( mM/L)	3161 ±0152	5101 ±1164	11134 ±2108	12145 ±0132	14187 ±0113	16126 ±1142
15 周 ( n = 6)
TC ( mM/L)	45140 ±6172	42140 ±2157	109120 ±2135	106190 ±5137	121176 ±5112	115145 ±1127
TG ( mM/L)	2116 ±0131	1197 ±0188	3192 ±0146	3138 ±0154	4116 ±0151	4113 ±0146
LDL ( mM/L)	18182 ±5135	17140 ±2123	49173 ±4126	60160 ±5173	57165 ±8152	55149 ±4126
HDL ( mM/L)	3109 ±1128	4189 ±1149	10145 ±1139	11189 ±0127	13121 ±2103	14178 ±0128

    二、肝脏形态学观察

    普通饮食喂养的小鼠5 周龄时肝脏未见明显变化。随年龄增长，至15 周龄时，肝细胞出现脂肪变性，胞浆内散在有大小不等的脂滴(图1)。高脂高胆固醇喂养的小鼠5 周龄时，肝脏表现出轻度的脂肪变性。喂养12 周后，大小不等的脂滴融合成较大的脂滴，充满于肝细胞质内，使肝细胞体积明显增大。添加高糖饮水的小鼠肝脏脂肪变性程度与同周龄单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠相比更为严重；大蒜素处理组小鼠在普通饮食条件下与蒸馏水安慰剂处理的小鼠相比肝脏脂肪变性程度略有减轻( 图2)。增加高糖饮水的小鼠肝脏脂肪变性程度较同周龄单纯高脂高胆固醇饲料喂养的小鼠相比更为严重；大蒜素给药处理的小鼠在普通饮食条件下与蒸馏水安慰剂处理的小鼠相比肝脏脂肪变性程度略有减轻，但并不明显。
   
    图1 生理盐水安慰剂对照组小鼠的肝脏冰冻切片油红O染色 A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）；B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）；C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固醇饲料（×600）；D：12周龄ALO小鼠，高脂高胆固醇饲料（×600）；E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固醇饮食（×500）；F：12周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固醇饮食（×600）
   
    图2  大蒜素给药组小鼠的肝脏冰冻切片油红O染色  A：5周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）；B：15周龄ALO小鼠，普通饮食（×600）；C：5周龄ALO小鼠，高脂高胆固醇饲料（×600）；D：12周龄ALO小鼠，高脂高胆固醇饲料（×600）；E：5周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固醇饮食（×600）；F：12周龄ALO小鼠，高糖高脂高胆固醇饮食（×600）

    三、主动脉内膜形态学改变

    所有实验组小鼠主动脉均有不同程度的动脉粥样硬化改变。主动脉根部内膜有堆积分布的泡沫状细胞病变区，平滑肌细胞增殖，内膜增厚，结缔组织增生以及胆固醇结晶核等出现(图3，4)，其病变的程度依次为高脂高胆固醇/高糖组>高脂高胆固醇+普通饮水>高脂高胆固醇+大蒜组>普通饮食+大蒜组。
   
    图3 高脂高胆固醇/高糖喂养的15周龄小鼠主动脉，有明显的动脉粥样硬化病变（HE染色×600）

    图4 大蒜素处理组，病变较前者轻（HE染色×600）

    讨 论

    apoE 基因的缺失导致对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍，使TC、LDL 和VLDL 增高、泡沫细胞形成并堆积于血管壁内。LDLR 基因缺乏的人或小鼠由于富含apoB - 100 的LDL 聚集，TC 中度增高，动脉粥样硬化也较缓慢且轻微。而当apoE 依赖的LDLR 途径和非LDLR 途径受阻时会导致小鼠在幼龄时即出现乳糜微粒、LDL 和IDL 增高，血脂代谢异常和动脉粥样硬化的病变程度更为严重。瘦素受体介导瘦素参与体内脂肪和糖等能量及脂蛋白的代谢与调节，其基因缺失的小鼠幼龄开始即出现病理性肥胖、胰岛素抵抗, 并伴有血糖、TG 及TC 的轻度升高，但无明显的动脉粥样硬化性病变[ 6 ] 。提示瘦素/ 瘦素受体相关代谢途径在血脂代谢中不占主要地位。

    高血糖能产生超氧化应激反应, 增加体内氧自由基和糖基化终产物的生成, 导致内皮受损、LDL 的氧化和糖基化以及高胆固醇血症的发生；修饰的LDL 可促进单核细胞迁入动脉内膜并转变成泡沫细胞。高血糖还可促进动脉平滑肌细胞的增生和聚集，参与ALO 小鼠血脂紊乱及动脉粥样硬化发生发展，加速粥样斑块的形成。

    因此，脂代谢相关的apoE、LDLR、db 基因联合突变导致了ALO 小鼠普通饮食组从3 周龄开始即出现血脂、血糖的紊乱及血浆脂蛋白水平的异常，且发生时间提前，说明apoE 和LDLR 双基因缺失，联合db 基因突变加重了由血脂代谢转运障碍导致的血脂紊乱和血浆脂蛋白异常，引发了血糖代谢失衡，从而加速了动脉粥样硬化性病变的发生发展。高脂高胆固醇饮食的诱导作用加速了这一病理过程。因此，三基因突变对血脂紊乱和动脉粥样硬化的影响不仅是单个基因突变效应的加和，多基因间的相互影响和作用在ALO 小鼠血脂紊乱及动脉粥样硬化性病变的发生发展中发挥了重要的作用。

    大蒜含有丰富的蛋白质、糖类、维生素及矿物质等。大蒜素，即二烯丙基硫代亚磺酸酯, 是大蒜油中的主要成分。大蒜素对血管的作用是通过降低血浆总胆固醇及肝脏cAMP 水平等作用实现的。大蒜素由于具有较强的还原性而具有抗氧化能力, 能与活泼自由基反应，形成稳定的新自由基，从而切断引起油脂自动氧化的自由基链式反应—大蒜提取物含还原态硫，有较强的还原性，能将过氧化物及氧还原，从而发挥抗氧化作用。

    大蒜素对高胆固醇血症动物的保护机制是在增加脂质分解和抑制胆固醇及脂肪酸合成途径的关键酶系统中发挥作用的。高脂血症可引起血小板聚集性升高，促进动脉粥样硬化、缺血性心脏病、血栓等的形成和发展。研究表明，大蒜素可降低机体血浆内皮素的水平，这对预防和缓解冠脉痉挛、减小外周血管张力。同时，大蒜素对血浆一氧化氮浓度有提升作用。另外，大蒜素能对乙醇所致的各种抗氧化酶的变化有逆转效应，对乙醇性肝损伤的保护作用与其增强肝脏抗氧化作用有关。本文在前期实验的基础上增加了高糖饮水对小鼠脂肪堆积及血脂异常的影响，并由此影响动脉病变的进程，初步探讨了大蒜提取物的主要成分—大蒜素在缓解和治疗动脉粥样硬化病变中所发挥的作用。本实验结果显示大蒜素对于因高糖高脂高胆固醇饮食不当引起的血脂异常及动脉粥样硬化均有一定的疗效，表现在对血脂TC、LDL - C 两项血液生化指标有一定程度的降低，分别达到6% 、4. 5% 左右，同时对于动脉斑块的形成也有一定程度的抑制。本工作的后续实验将深入开展脂代谢相关功能蛋白的蛋白质组学分析研究、大蒜素成分的进一步分离纯化及其药物代谢、药物动力学研究以及降血脂和抗动脉粥样硬化的机理研究，为今后相关疾病的防治药物的开发提供有益的参考数据。

参 考 文 献

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    大蒜素对动脉粥样硬化小鼠血脂代谢的影响