摘要

    目的 探讨抗血小板药物、抗CD40L 抗体及合用对动脉粥样硬化的影响。方法 雄性载脂蛋白E 基因敲除小鼠随机分为模型对照组、抗血小板药物组（阿司匹林+氯吡格雷）、抗CD40L 抗体组、合用组（阿司匹林+氯吡格雷+抗CD40L 抗体）。测血脂、sVCAM-1 和sICAM-1浓度。观察主动脉组织病理形态学改变，测定斑块巨噬细胞、平滑肌细胞百分率。Western杂交分析测定MMP-9 的蛋白表达。结果 抗血小板药物及抗CD40L 抗体治疗可明显降低sVCAM-1 和sICAM-1 浓度（P<0.01），减轻动脉粥样硬化，减少斑块巨噬细胞，增加平滑肌细胞（P<0.05），对血脂无影响（P>0.05），合用则作用增强（P<0.05）。抗CD40L 抗体可降低MMP-9 的表达（P<0.01），抗血小板治疗无此作用。结论 抗血小板治疗及阻断CD40 信号可抑制炎症反应，减轻动脉粥样硬化，稳定斑块，对血脂无影响，联合治疗有协同作用。

    1.引言

    动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种多因素、多环节的慢性炎症性疾病 [1]。抗血小板药物是防治AS 最基本的治疗，新近的研究表明其还可抑制斑块进展 [2-4]。而CD40-CD40L 系统作为重要的炎症信号通路，可能是AS 进展的关键环节[5]。本研究以载脂蛋白E 基因敲除小鼠为AS 动物模型，对比观察抗血小板治疗和阻断CD40 信号以及两者联合治疗对AS 病变的影响，为临床防治AS 提供一个可能的新的思路。

    2.材料与方法

    材料：阿司匹林，无锡阿斯特拉制药有限公司；氯吡格雷，塞诺菲圣德拉堡民生制药有限公司；小鼠抗CD40L 抗体，美国SouthernBiotech 公司。

    研究对象分组：8 周龄雄性载脂蛋白E 基因敲除小鼠37 只，由北京维通利华实验技术有限公司提供。予以西方饮食（常规小鼠饲料+20%脂肪+0.15%胆固醇）喂养，建立实验性动脉粥样硬化模型，随机分为4 组：① 模型对照组（n=10）；②抗血小板药物组（n=10，阿司匹林58mg/kg·d^-1+氯吡格雷14mg/kg·d^-1 灌胃）；③ 抗CD40L 抗体组（n=8，250ug/0.5mL腹腔注射，2 次/周）；④合用组（n=9，阿司匹林58mg/kg·d^-1 和氯吡格雷14mg/kg·d^-1 灌胃+抗CD40L 抗体250ug/0.5mL 腹腔注射，2 次/周）。高脂饮食喂养和治疗共16 周。取与载脂蛋白E 基因敲除小鼠有相同遗传背景的健康雄性近交系C57BL/6 小鼠6 只作为正常对照。

    生化指标测定：小鼠麻醉后摘除眼球取血，用7060 型全自动生化分析仪（日本HITACHI公司生产）测定血清总胆固醇、甘油三酯；采用酶联免疫吸附法测血清可溶性血管细胞粘附分子-1（soluble vascular cell adhesion molecule-1，sVCAM-1）、可溶性细胞间粘附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）水平（试剂盒购自美国LIFEKEY 公司）。

    病理形态学观察：各组动物麻醉后，剪开胸腔，游离主动脉，剥离外膜脂肪组织。大体标本纵行剖开，置于10%福尔马林液中固定，行油红O 染色后摄像，采用天地病理和细胞图像分析系统TD200 测量斑块面积和内膜面积，计算斑块/内膜面积比。取主动脉分为胸主动脉和腹主动脉2 部分，胸主动脉均分为3 段，每段分别切取4μm 厚的标本制成病理切片，行苏木素-伊红、弹力纤维染色，将动脉等距分成5 点（包括内膜最厚处），采用图像分析系统测量血管横断面的管壁厚度、斑块截面积，最后将3 段标本切片的各相应指标加以平均。

    免疫组织化学分析：取4μm 厚的胸主动脉组织横截面切片做巨噬细胞、平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色，采用图像分析系统计算阳性百分率。

    Western 杂交分析：将液氮保存的腹主动脉组织进行Western 杂交分析，方法参照文献[6] 。一抗基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG（0.8g/L）抗体（购自北京中山生物技术有限公司）1：1000 稀释。

    统计学分析：各计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析， P<0.05为差异有显著性。统计学分析均用SPSS11.5 软件。

    3.结果

    血脂水平变化：正常对照组实验前后血脂水平无变化（P>0.05）。模型对照组和各治疗组高脂饮食喂养16 周后，甘油三酯水平无明显改变（P>0.05），总胆固醇水平则较实验开始时显著升高（P<0.01）。模型对照组和各治疗组之间血脂水平变化无显著性差异（P>0.05）（见表1）。

    表1. 各组小鼠的血脂水平比较

	正常对照组	模型对照组	抗血小板药物组	抗CD40L 抗体组	合用组
甘油三酯（mmol/L）
实验前	1.19±0.46	3.41±0.90a	2.98±0.85 a	2.85±0.55 a	3.02±0.73 a
实验后	1.42±0.53	2.85±0.55 a	3.19±1.04 a	3.10±0.89 a	2.89±0.83 a
胆固醇（mmol/L）
实验前	2.79±0.26	16.06±6.56b	16.59±4.23 b	17.04±6.41 b	17.34±7.07 b
实验后	3.26±1.01	26.77±8.47 b,c	31.63±8.90 b,c	28.64±6.77 b,c	30.39±8.12 b,c

    a： P<0.05， b：P<0.01，与正常对照组比较；c：P<0.05，实验后与实验前比较。

    血清sVCAM-1 和sICAM-1 浓度变化：各治疗组sVCAM-1 和sICAM-1 浓度显著低于模型对照组（P<0.01）；各治疗组之间，抗血小板药物组和抗CD40L 抗体组之间没有显著差异（P>0.05），合用组的水平明显低于抗血小板药物组和抗体组（P<0.05）（见表2）。

    病理形态学变化

    主动脉纵剖面大体标本：正常对照组主动脉内膜光滑平整，管壁呈半透明状。模型对照组管壁病变最明显，斑块面积、斑块/内膜面积比明显大于各治疗组（P<0.05），其中，抗血小板药物组和抗CD40L 抗体组之间没有显著差异（P>0.05），合用组的水平明显低于抗血小板药物组和抗体组（P<0.05）（见表2）。

    主动脉横截面组织切片：正常对照组动脉内膜无脂纹和斑块形成，弹力板完整。模型组有明显斑块形成，含大量泡沫细胞，富含脂质，可见胆固醇结晶，管壁厚度、斑块截面积显著大于各治疗组（P<0.05），弹力板变性、断裂。抗血小板药物组与抗CD40L 抗体组病变减轻各指标在抗血小板药物组与抗体组间无显著差异（P>0.05）。合用组病变最轻，斑块较小，泡沫细胞和脂质减少，管壁厚度、斑块截面积明显小于抗血小板药物组和抗CD40L 抗体组（P<0.05），弹力板基本完整（见表2，图1）。
   

    图1. 小鼠主动脉组织切片（×200）A 为模型组，B 抗血小板药物组，C 为抗CD40L 抗体组，D 为合用组。

    免疫组织化学分析结果：与模型组相比，抗血小板药物组、抗CD40L 抗体组及合用组斑块中的巨噬细胞阳性百分率分别降低了49.65%、52.21%、90.72%，而平滑肌细胞含量则分别增加118.80%、114.23%、227.54%（P<0.05），其中合用组水平显著低于抗血小板药物组与抗CD40L 抗体组（P<0.05），而抗血小板药物组与抗体组间没有显著差异（P>0.05），（见表2，图2）。

    表2. 各组小鼠可溶性血管细胞粘附分子-1、可溶性细胞间粘附分子-1 和病理学指标结果比较

	模型对照组	抗血小板药物组	抗CD40L 抗体组	合用组
sVCAM-1（ng/mL）	780.61±128.47	432.37±83.47 a	406.15±86.98 a	305.76±89.81a,b
sICAM-1（ng/mL）	743.72±109.42	515.54±79.85 a	491.60±128.79a	393.32±83.85a,b
斑块大体面积（mm2）	9.41±3.95	3.40±0.97a	3.17±1.58a	1.07±0.45 a,b
斑块/内膜面积比	43.77±15.63%	16.99±4.32% a	16.38±6.84%a	5.71±2.86%a,b
管壁厚度（μm）	110.61±21.40	57.28±12.66 a	52.65±10.75a	34.85±7.15 a,b
斑块截面积（μm2）	35698.89±5042.91	18091.56±4642.05a	18289.70±7673.13a	8464.19±3890.55a,b
平滑肌细胞阳性率	7.66±4.04%	18.45±4.45%a	18.41±4.26%a	25.09±3.52%a,b
巨噬细胞阳性率	43.23±14.29%	16.42±6.98% a	15.88±4.65%a	4.01±2.53% a,b

    a： P<0.01，与模型对照组比较；b：P<0.05，与抗血小板药物组和抗CD40L 抗体组比较。

   
    平滑肌细胞

    巨噬细胞
    图2. 小鼠主动脉粥样硬化病变的免疫组织化学分析（×400）A 为模型组，B 抗血小板药物组，C 为抗CD40L抗体组，D 为合用组。

    基质金属蛋白酶-9 蛋白的表达：模型对照组、抗血小板药物组、抗CD40 配体抗体组、合用组MMP-9 蛋白的表达分别是正常对照组的430.38%、404.96%、221.80%、262.33%，与模型组相比，抗血小板药物组没有显著差异；抗CD40L 抗体组和合用组则明显下降（P<0.01），两组间无显著差异（P>0.05）（见图3）。
   
    图3. 小鼠主动脉组织的基质金属蛋白酶-9 蛋白表达 1 为模型组，2 为抗血小板药物组，3 为抗CD40L 抗体组，4 为合用组，5 为正常对照组。

    4.讨论

    AS 的发生、发展是一种多因素、多环节的复杂过程，目前已经明确，AS 是涉及血小板、白细胞、平滑肌细胞等多种细胞和多种因子的炎症反应[1]。抗血小板治疗是临床应用最广的防治AS 的干预措施，已经有研究发现，应用抗血小板药物除了其抗血栓的作用以外，还可以抑制AS 病变的进展 [2-4]。本研究室的顾晴等应用兔AS 模型证实阿司匹林、氯吡格雷均有抑制斑块进展的作用，联用则作用增强[7]。CD40-CD40L 作为重要的炎症信号通路，其作用几乎贯穿了AS 斑块发生、发展和破裂的全过程，被认为可能是这一炎症进程的关键环节[5]。因此，抗血小板治疗与阻断CD40 信号通路应该是防治AS 非常有效的干预手段，而联合应用则可能从多个角度更为有效的干预AS。

    本研究首次将抗血小板与阻断CD40 信号通路这两种治疗进行了比较，并观察了两者联合使用治疗AS 的益处。抗血小板治疗选用的是两种不同途径的药物——环氧化酶抑制剂阿司匹林(剂量相当于成人300mg/日)和二磷酸腺苷受体拮抗剂氯吡格雷（剂量相当于成人75mg/日），以阻断血小板活化的多种途径，避免单药治疗所常见的药物抵抗问题；阻断CD40信号通路采用的是抗CD40L 抗体治疗，应用抗体可阻断体内90%以上CD40-CD40L 系统的作用[8]；因兔AS 模型与人类有一定的差别，因此以AS 病变与人类极为相似的载脂蛋白E 基因敲除小鼠作为实验动物模型[9]，并予以高脂饮食喂养加速AS 的形成，探讨抗血小板治疗、阻断CD40-CD40L 系统以及两者联合应用对AS 斑块进展和稳定性的影响。

    首先通过主动脉大体标本和组织切片两个角度观察AS 病变的情况，研究显示，与模型组相比，抗血小板治疗以及抗CD40L 抗体治疗使斑块大体面积、斑块/内膜面积比值以及血管壁厚度、斑块的截面积均显著下降，两组间没有显著差异，合用组则下降程度更明显。由此表明，抗血小板治疗以及应用抗CD40L 抗体阻断CD40 信号通路均能明显抑制AS 斑块的进展，联合治疗有协同作用。

    进一步观察对斑块稳定性的影响，结果发现，予以抗血小板治疗或抗CD40L 抗体治疗后，斑块组成成分均发生了改变，斑块内的炎症细胞巨噬细胞显著减少，脂质成分亦减少，而构成纤维帽并合成胶原的平滑肌细胞数量增加，从而使斑块趋于稳定。抗血小板与抗CD40L抗体治疗作用相仿，合用疗效增强。由于斑块的稳定性相对于其大小，对斑块破裂并发急性血栓的影响更大，临床意义也就更为重要。

    斑块的稳定性还同其中的MMP 含量密切相关，它能够降解细胞外基质，引起斑块的破裂[10]，其中MMP-9 在斑块中含量较多，活性较强[11]，还有促进斑块增长的作用[12]。本研究即通过检测其含量了解斑块的稳定性。在给予抗CD40L 抗体治疗后，无论有无联合应用抗血小板药物，主动脉MMP-9 的表达均明显减少，表明阻断CD40-CD40 配体信号通路，能够通过减少细胞外基质的降解，进一步稳定斑块。这与已有的报道结果相吻合[5，13]。而单纯应用抗血小板治疗则未发现这一作用。

    为了解干预治疗对炎症的抑制作用，本研究检测了sVCAM-1 和sICAM-1 的水平。VCAM-1和ICAM-1 在AS 炎症过程的各个阶段都起着重要的作用[14]，血sVCAM-1 和sICAM-1 的水平是局部和全身炎症反应的可靠标志物[15]。结果发现，各治疗组sVCAM-1 和sICAM-1 明显下降，并且与抑制斑块进展的程度相关，合用组的水平最低。因此，抗血小板药物及抗CD40L 抗体均可减少粘附分子的表达、减轻炎症反应，而联合治疗则更大程度的抑制了炎症过程，从而阻遏了AS 的进展。

    此外，血脂代谢的变化情况表明，各治疗组与模型组的总胆固醇和甘油三酯水平没有显著差异，血小板途径和CD40信号通路对血脂并没有作用，其对AS的影响并不通过这一路径起作用。

    AS是一种多因素、多环节的炎症反应，其发生发展的过程及其复杂，这决定了防治AS的方案决不会仅局限于一种药物，它必然应该是联合治疗。我们的研究证实，抗血小板治疗和阻断CD40-CD40L系统均能够抑制炎症反应、减轻AS病变，并稳定斑块，联合治疗可同时对AS的多个环节进行干预，包括血小板活化、血栓形成以及炎症通路等，对AS的防治有协同作用。上述结果可能为AS的干预治疗提供新的方向和理论依据。

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    抗血小板药物与阻断CD40 信号对动脉粥样硬化影响