【摘要】 目的探讨晚期糖基化终产物(AGE)对动脉粥样斑块形成的影响及机制。方法50只新西兰白兔随机分为5组，A组：喂饲高胆固醇饲料加注射AGE修饰的兔血清白蛋白(AGE-RSA，5 mg／kg，1次／隔天)；B组：喂饲高胆固醇饲料加注射未加修饰的兔血清白蛋白(RSA，5 mg／kg，1次／隔天)；C组：单纯喂饲高胆固醇饲料；D组：喂饲普通饲料；E组：喂饲普通饲料加注射AGE-RSA(5 mg／kg，1次／隔天)。10周后取主动脉全段，苏丹Ⅳ染色，PHOTOSHOP系统测定粥样斑块面积占内膜面积的百分比，免疫组化法观察主动脉AGE、氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)、丙二醛修饰低密度脂蛋白(MDA－LDL)的沉积及AGE受体(RAGE)的表达。同时检测循环AGE、血脂、血清硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSHPx)活性、丙二醛(MDA)及氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)水平。结果(I)喂饲高胆固醇饲料各组动物主动脉均见粥样硬化斑块形成，但A组动脉粥样斑块面积／内膜面积百分比(50％±8％)明显高于B组(21％±7％)和c组(29％±6％)(P均<0.05)，A组粥样斑块病变部位MDA-LDL、OX-LDL、AGE的沉积面积较B、C组明显增大，内皮细胞RAGE表达上调；而D组和E组主动脉未见粥样斑块病变。(2)喂饲高胆固醇饲料各组动物的血清甘油三酯及胆固醇水平明显增高，但各组间差异无显著意义。A组循环AGE、MDA、OX-LDL水平明显高于B、C、E组，SeGSHPx活性显著低于B、c、E组。(3)血清AGE水平与血清OX—LDL(r=0.459，P<0.01)及血清MDA(r=0.423，P<0.05)呈正相关，与血清SeGSHPx呈负相关(r：-0.448，P<0.01)；血清AGE水平与主动脉RAGE表达面积(r=0.384，P<0.05)及AGE沉积面积(r=0.468，P<0.05)呈正相关。结论AGE加速实验性高脂血症动物动脉粥样斑块形成，其机制可能与增加氧化应激、促进脂蛋白氧化及上调RAGE表达有关。
动脉粥样硬化(AS)性心血管疾病是终末期肾脏病(ESRD)患者的常见并发症和重要死亡原因，其发病机制目前尚不完全清楚。我们和国外学者的研究表明，ESRD患者循环中晚期糖基化终产物(AGE)潴留，血管壁AS病变部位可见AGE的沉积 ，提示AGE潴留可能与ESRD患者AS的发生、发展有关。我们近期的研究发现，给实验动物反复静脉注射AGE等糖化和氧化终产物修饰的蛋白质能加速AS的形成，但其机制尚不清楚。本研究拟通过实验性AS模型，进一步探讨AGE对动脉粥样硬化斑块形成的影响及其可能的机制。
材料与方法
一、体外制备AGE修饰的蛋白质
按我们以往的方法 ，用糖孵育法制备AGE修饰的兔血清白蛋白(AGE-RSA)，以经过同样处理但未加葡萄糖孵育的RSA作为对照。体外制备的AGE-RSA经荧光分光光度法鉴定，其AGE含量为85.2 U／mg蛋白质，对照样本AGE含量不超过0.9 U／mg蛋白质。所有样品均经TCL试剂盒(美国Endo公司)检测，其内毒素含量均低于10 PS／ml。
二、实验动物分组
12周龄健康雄性新西兰纯种白兔50只(第一军医大学实验动物中心提供)，在恒温清洁环境(第一军医大学南方医院动物所提供)饲养，1周后分为5组，每组10只。A组：喂饲0.5％ 高胆固醇饲料(日本Yakult公司)，同时静脉注射AGE-RSA(5 ms／kg，1次／隔天)；B组：喂饲0.5％高胆固醇饲料，同时静脉注射未加修饰的RSA(5 ms／kg，1次／隔天)；C组：喂饲0.5％高胆固醇饲料；D组：喂饲普通饲料；E组：喂饲普通饲料，同时静脉注射AGE.RSA(5 ms／kg，1 7欠／隔天)。注射AGE-RSA的剂量根据预实验的结果而定，该剂量使血清AGE水平较正常值增高约1.0～1.5倍，与ESRD患者循环AGE潴留程度(正常上限的1.5倍)相仿。
三、病理形态学观察
10周时实验兔经盐酸二氢埃托啡(0.2 ml／kg)麻醉，股动脉放血处死。分离主动脉全段，4％ 甲醛溶液(pH7.4)固定，苏丹Ⅳ染色。按文献方法 分别取主动脉根部、胸主动脉、腹主动脉组织，在PHOTOSHOP 7.0图像分析系统上测定粥样斑块面积和动脉内膜面积，并以粥样斑块面积(总和)占动脉内膜面积(总和)的百分比表示粥样硬化斑块病变的程度。
四、免疫组织化学染色
动脉组织标本用10％ 甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，常规脱蜡、脱水，封闭内源性过氧化物酶；之后分别滴加下列第一抗体：抗AGE单克隆抗体(日本东海大学Toshio Miyata教授惠赠)，抗丙二醛修饰的低密度脂蛋白(MDA-LDL)和抗氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)单克隆抗体(本实验室研制)，抗RAGE多克隆抗体(Chemicon公司)。第一抗体结合部位分别用Evision法(Dako公司)检测AGE、MD-LDL、ox-LDL的沉积，SABC法(博士德公司)检测RAGE的表达；采用DAB(Dako公司)显色，苏木素复染，脱水，封片。Macintoshll图像分析系统(Adobephotoshop 5.0)测定AGE、MDA-LDL、ox-LDL、RA GE在主动脉壁的着色强度，结果以阳性单位(PU)表示，同时测定阳性区域面积，结果以μm2表示 。
五、血清学指标检测
实验前和处死动物前经兔耳中央动脉采血，3000r/min离心。用自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平；DTNB法测定血清硒谷胱甘肽过氧化物酶（SeGSHPx）活性；硫代巴比妥酸反应法测定血清丙二醛（MDA）；竞争ELISA法测定血清AGE、氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL）。
结果
一、AGE-RSA对动脉粥样硬化斑块形成的影响
喂饲普通饲料的D组和喂饲普通饲料加注射AGE-RSA的E组主动脉未见粥样斑块；喂饲高胆固醇饲料加注射RSA的B组及单纯喂饲高胆固醇饲料的C组主动脉可见少量斑块形成，主要集中在主动脉根部；而喂饲高胆固醇饲料加注射AGE-RAS的A组主动脉可见大量粥样斑块形成，分布于整条血管。粥样斑块面积占内膜面积百分比在A、B、C组分别为50％±8％、21％±7％和29％±6％，A组粥样斑块面积明显大于B及C组（P<0.05）。
二、主动脉免疫组化染色
D组和E组主动脉壁未见AGE、MDA-LDL或ox-LDL阳性着色，而喂饲高胆固醇饲料的A、B、C组动脉粥样硬化病变处均可见上述抗体的阳性染色，主要位于内皮细胞、泡沫细胞的胞浆及胞膜表面（图1）；免疫组化半定量分析结果显示，注射AGE-RSA的A组AGE、MDA-LDL和ox-LDL沉积的面积明显大于喂饲高胆固醇饲料加注射RSA的B组及单纯喂饲高胆固醇饲料的C组，但着色强度3组间差异无显著意义（表1）。
A、B、C组均可见抗RAGE抗体的阳性染色，主要位于内皮细胞及泡沫细胞的胞浆及细胞表面，A组RAGE表达的阳性面积明显大于B组及C组（P<0.05）；但抗RAGE抗体的着色强度各组间差异无显著意义（表1）。D组主动脉壁未见明显RAGE表达；E组仅于内皮细胞的胞浆及细胞表面可见抗RAGE抗体的阳性染色，其表达的阳性面积（中位数0.07×105μm2）明显小于A、B、C组（P<0.05）。
三、血清学指标的变化
喂饲高胆固醇饲料10周后A、B、C组的血清TC及TG水平均显著增高，但各组间差异无显著意义。喂饲高胆固醇饲料加注射AGE-RSA的A组及喂饲普通饲料加注射AGE-RSA的E组10周时循环AGE水平明显高于基线水平；B、C组10周时循环AGE水平亦较基线值有所升高，但其水平明显低于A、E组；A组第10周时血清MDA及ox-LDL水平较基线值明显增高，并显著高于同期B、C、E组，SeGSHPx水平则明显低于B、C、E组（表2）。所有动物血清AGE水平与血清ox-LDL（r=0.459，P<0.01）及血清MDA（r=0.423，P<0.05）呈正相关，与血清SeGSHPx呈负相关（r=-0.448，P<0.01）。血清AGE水平与动脉壁RAGE表达面积(r=0.384，P<0.05)及AGE沉积面积(r=0.468，P<0.05)呈正相关。
讨 论
AGE是蛋白质的氨基与糖的醛基之间非酶性糖化氧化反应的终产物。正常情况下体内AGE水平随年龄增长而缓慢增加。慢性肾衰等疾病状态下循环AGE水平异常增高。近年一些临床研究证实，ESRD患者动脉粥样斑块中有AGE的沉积 ，同时ESRD患者循环AGE水平与颈动脉中层厚度呈正相关 。这些资料提示，AGE潴留可能与ESRD患者加速性动脉粥样硬化的发生、发展有关，但迄今为止尚无直接证据表明AGE与动脉粥样硬化存在因果关系。我们的研究表明，喂饲高胆固醇饲料可导致兔动脉粥样硬化斑块形成，而反复注射AGE—RSA的动物动脉粥样斑块面积明显大于单纯喂饲高胆固醇饲料及喂饲高胆固醇饲料加注射RSA的动物，证实循环AGE负荷可加速高脂动物动脉粥样斑块的形成。
AGE促进动脉粥样斑块形成的机制是一值得探讨的问题。已证实高胆固醇血症是促发动脉粥样硬化的重要原因。我们的资料提示，动脉粥样硬化病变仅见于喂饲高胆固醇饲料的动物，提示高脂血症是形成动脉粥样斑块的必要条件。提高循环AGE水平，能增加喂饲高胆固醇饲料动物动脉粥样硬化病变的面积，但不能使喂饲普通饲料动物发生动脉粥样硬化，进一步支持这一假说。ESRD患者多数存在脂质代谢紊乱，可能是这部分患者动脉粥样硬化易于发生的重要因素。令人感兴趣的是本研究资料表明，喂饲高胆固醇饲料的3组动物血清甘油三酯和胆固醇水平差异并无显著意义，提示AGE加速动脉粥样斑块形成的机制与血脂变化无明显关系。近年研究发现，动脉粥样硬化的发生与氧化应激关系密切。氧化应激是体内活性氧的产生和清除失去平衡的结果，活性氧增加引起LDL的氧化修饰，形成的OX-LDL，ox-LDL被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞，这是导致动脉粥样斑块形成的重要病理生理环节。本研究结果证实，注射AGE—RSA可使循环中反映氧化水平的MDA、ox-LDL水平明显增加，而抗氧化指标SeGSHPx显著降低，且AGE水平与上述氧化和抗氧化指标存在显著相关关系，提示AGE负荷促进机体氧化应激。喂饲高胆固醇饲料加注射AGE—RSA组动物血管壁MDA-LDL及ox-LDL的沉积明显增加，这足以证明动脉粥样硬化加重与氧化应激水平增高有关。近年体外实验也已证实，AGE能刺激循环和血管细胞生成活性氧。B、C组10周时循环AGE水平亦较基线值有所升高，推测可能与高脂血症有关。有研究证实，高胆固醇血症可诱导活性氧的生成，而活性氧水平增加是催化AGE形成的重要因素 。
近年大量资料证实，动脉粥样硬化的本质是炎症。在体外研究中，AGE具有促进IL-1β和TNF-α等促炎症细胞因子释放的作用。AGE的促炎症效应主要通过细胞表面AGE受体(RAGE)所介导。已证实ESRD患者循环单核细胞RAGE的表达上调，RA GE表达增加促使细胞结合更多AGE，释放更多促炎症因子，从而形成炎症的正反馈环。本组结果首次证实，循环AGE负荷能上调血管内皮细胞RA GE的表达。RAGE表达增加可能进一步放大循环或局部沉积的AGE的促炎症效应，从而促进动脉粥样硬化的发生、发展。
 晚期糖基化终产物通过氧化应激加速动脉粥样硬化斑块形成 |
