摘 要：
目的 设计局部狭窄而导致血流动力学改变的实验模型，探讨剪切应力对血管内膜增生以及动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法 兔颈总动脉平直段套环形成狭窄度为40%的局部狭窄，分别饲以正常饮食以及高脂高胆固醇饮食4周；数值计算的方法模拟血流流场和剪切应力分布及其特征；氧化酶法测定血浆总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的浓度；HE染色检测颈总动脉病理改变；Verhoeff法染色观察血管弹力纤维分布；油红O染色观察斑块内的脂质沉积；HPLC检测血管壁脂质含量。结果 套环形成局部狭窄后，颈总动脉血流流场发生显著的扰动，狭窄远心端有涡流以及二次流形成；狭窄近心端形成局部高剪切应力区域，而在远心端形成振荡的低剪切应力区域。4周后，高脂高胆固醇组空腹血浆总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平升高，普通饮食组血脂水平没有明显改变，HE染色显示普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组颈总动脉狭窄的近心端和远心端均有明显的内膜增生以及动脉粥样硬化斑块形成，近心端比远心端病变更严重，并且近心端增生内膜的细胞成分主要为圆形的泡沫细胞而远心端增生内膜的细胞成分主要为梭形平滑肌细胞；Verhoeff染色显示病变处弹力纤维排列紊乱，部分内弹力板断裂；油红O染色发现增生的内膜中有大量的脂质沉积；HPLC检测也表明狭窄近心端以及远心端血管段胆固醇含量明显增加。结论 高剪切应力以及低振荡剪切应力均引发动脉粥样硬化病变的形成，高剪切应力诱导不稳定性斑块的形成，低振荡剪切应力诱发稳定性斑块的形成。
研究表明动脉粥样硬化总是发生在动脉的弯曲、分叉及狭窄部位，如主动脉弓、颈动脉分支、冠状动脉、腹主动脉分支和股动脉分支等特殊部位，学术界称此现象为动脉粥样硬化的局灶性。研究表明，血流动力学因素对动脉粥样硬化局灶性起着非常重要的作用，而流动产生的剪切应力是其中的关键因素。研究认为剪切应力改变可以使内膜局部受损并促进斑块形成，Fry等[1]认为高剪切应力损伤内膜促进动脉粥样硬化的发生发展，而Cao等[2]认为低剪切应力是诱导动脉粥样硬化斑块形成的主要原因。由于Fry所推测的损伤内皮细胞层的切应力水平远在正常生理水平之上，因此很多学者对高切应力学说持否定态度，但单纯的低剪切应力还不足以充分解释动脉粥样硬化斑块自出现后同时有颈向及下游轴向发展的趋势[3]。为了进一步探讨不同剪切应力对动脉粥样硬化发生发展的影响，本文采用外科手术的方法，在兔的左颈总动脉套环作一狭窄度为40%的局部狭窄，改变狭窄的远心端和近心端局部剪切应力，并以右颈总动脉作为对照，探讨剪切应力特性对动脉粥样硬化病变形成和发展的影响。
1. 材料和方法
1.1 颈总动脉局部狭窄动物模型的建立
本课题得到教育部科学技术研究重点项目(1041580)，重庆市教委科技项目（030001），国家自然基金（30670517, 10632010）及 “111计划”（B06023）的资助。
参考Cheng C等方法[4]，简述如下：腹腔注射戊巴比妥钠溶液，麻醉；头颈拉直，充分暴露颈部；除毛，络合碘涂布法消毒，铺设无菌孔巾；沿颈部正中线从甲状软骨与胸骨之间剪开皮肤，纵向钝性分离颈部肌群，暴露出气管。找到气管两侧的颈动脉鞘，用玻璃分针细心剥离鞘膜，分离出左、右侧颈总动脉；将硅胶管套于左侧颈总动脉上，手术线固定套环，喂养4周。
1.2局部狭窄血管流场的数值模拟
1.2.1局部狭窄血管的几何模型：
数值模拟所用动脉狭窄几何模型如图1所示，该狭窄血管段为一轴对称圆管，管径为0.15cm，与兔颈总动脉直径相当。r为狭窄段血管内径，R为平直段血管内径，以（R-r）/R代表狭窄程度，L2为0.8cm，L1为5cm。
图1 狭窄血管示意图
1.2.2控制方程和边界条件
假定血管壁为刚性，血液为不可压缩的牛顿流体，粘度μ为3.5mPa s，血液密度ρ=1.05×103 Kg/m3。在这些假设条件下，定常流的Navier-Stoke方程为：
V为速度矢量，u，v，w分别为x，y，z方向的速度矢量，P为血压
边界条件为：
u0为入口处速度，
1.2.3数值求解
数值求解通过fluent软件来实现
1.2.3.1 建立模型及网格划分
通过GAMBIT软件建立如图2所示狭窄率为40%的三维狭窄血管模型，血管入口直径取0.15cm，狭窄两端长度均为5cm。对模型进行网格划分，划分结果为3390个单元，以mesh格式保存。
图2 狭窄血管模型建立及网格划分
1.2.3.2设定边界条件
将网格划分后的图形导入Fluent软件中；检查网格的划分；选择求解器(3D)。选用求解模型，设定初始变量。
1.2.3.3后处理
设定好初始变量后，开始迭代求解。求解后，我们获取的结果包括血管内的流场分布、血管壁面剪切力。
1.3 血脂的测定
在手术前和手术后第4周，耳缘静脉采血，不抗凝。化学法测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），Friedwald公式计算低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），公式为LDL-C=TC－HDL-C－TG/2。
1.4主动脉脂质条纹染色
戊巴比妥钠麻醉，髂动脉插管放血法处死动物，取出整条主动脉（从主动脉弓至髂动脉分支下），清除外部的脂肪和结缔组织后用生理盐水将血管冲洗干净，10％福尔马林液固定，然后沿动脉纵向剪开，37℃浸泡于5g/L苏丹Ⅳ与70%的异丙醇配置的混合液中15min，70％的异丙醇冲洗3次，平铺照相。
1.5颈总动脉病理学观察
将10%中性福尔马林固定的颈总动脉经蒸馏水冲洗0.5-1 h，70%酒精浸泡24h，80%酒精浸泡24h，95%酒精Ⅰ浸泡30min，95%酒精Ⅱ30min，100%酒精Ⅰ浸泡30min，100%酒精Ⅱ浸泡30min，100%酒精与二甲苯混合液（1：1）浸泡20min，二甲苯Ⅰ浸泡20min，二甲苯Ⅱ浸泡20min，软蜡浸泡10min，硬蜡浸泡10min，包埋制成石蜡块，连续切片（厚度为5μm），摊片，60℃烤片1h，切片常规脱蜡入水，HE染色，光学显微镜下观察动脉粥样硬化斑块病变情况。
1.6油红O染色检测颈总动脉斑块内脂质蓄积[5]
将组织用4%甲醛固定24h，水洗5min，冰冻切片。60％异丙醇中放置5min，用新过滤的油红O（储备液含0.5％油红O、98％异丙醇，使用前用水稀释至50％，24h后过滤）染色10min，60％异丙醇分化5min，水洗5min，苏木素染色5min，水洗返兰，水性封片剂封片，显微镜下观察。
1.7血管壁胆固醇含量的测定
取血管，于冰上研磨，匀浆，取100μl研磨液Lorry法测定蛋白质含量。研磨液加入等体积新鲜配制的15％醇溶性氢氧化钾（－20℃保存），震荡至溶解产物清亮，加入一定量6％三氯乙酸去除其中的蛋白质成分，加入等体积的正己烷—异丙醇（两者溶液的体积比为4：1），震荡5min，15000rpm，4℃，离心5min，收集上层有机相，将下层水相按上述方法反复抽提两次，收集上层有机相，65℃真空冷冻干燥90min。室温冷却后加入0.1ml的流动相，震荡使之溶解，超声除气5min，15000 rpm，4℃，离心5min，收集上清液。
参考王佐等[6]的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定胆固醇含量。具体操作如下：取5μl样品进样，C4反相柱，以异丙醇：正庚烷：乙腈为流动相，非梯度洗脱，1ml/min，柱温40℃，检测波长216nm，检测到第8min，单位为μg/g蛋白。
1.8 统计学处理
实验数据用平均数±标准差(x±S)表示。采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，两两均数间的多重比较，采用Student t检验，P<0.05为差异达到显著水平。
2. 结果
2.1局部狭窄血管流场分布
由图3可知，当入口流速不太大时，狭窄下游存在强度很小的涡流。上游无狭窄段流场基本保持不变，直到狭窄入口处流场迅速改变；在狭窄远心端的流场明显发生改变，流场变得紊乱，有涡流形成。随着流速的增大，狭窄远心端的涡流强度也随之增大，并且流场也变得更为复杂。
图3 局部狭窄血管流场数值模拟
2.2局部狭窄血管的剪切应力分布
图4为数值计算所得壁面剪切应力的分布。壁面剪切应力在狭窄处的近前部稍微降低，然后突然升高达到峰值，随后急剧下降，但仍维持较高的剪切应力值。在狭窄的远心端壁面剪切应力迅速下降，直到接近于零，尔后又回升，逐步回复到无扰动层流值，形成一振荡性的低剪切应力区域。 
图 4 局部狭窄血管剪切应力分布
2.3饮食对血脂的影响
实验动物在高脂高胆固醇喂养4周后，TC迅速升高，高脂高胆固醇饲料组与普通饲料组相比差异显著，而普通饲料组在整个实验过程中TC变化很小，在高脂高胆固醇饲料喂养4周后，LDLC、TG也明显升高，与普通饲料组相比差异达显著水平。而HDLC虽然略有升高，但差异不显著。
表1.各组血脂水平比较（n＝7，mg/dL）
|
|
TC |
TG |
LDLC |
HDLC |
|
普通饲料组 |
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|
|
|
|
0周 |
65.8±18.3 |
72.1±21.6 |
43.2±19.3 |
14.6±3.9 |
|
4周 |
73.8±23.8 |
65.3±18.7 |
40.1±15.2 |
18.7±3.8 |
|
高脂高胆固醇组 |
|
|
|
|
|
0周 |
65.2±23.6 |
76.8±30.1 |
45.6±17.3 |
14.3±3.5 |
|
4周 |
768.6±260.3a |
110.3±21.5a |
688.5±190.3a |
18.2±7.3 |
a： P<0.05，与普通饲料组相比
2.4主动脉脂质条纹染色
在高脂高胆固醇组动物的主动脉明显可见动脉粥样硬化斑块和脂质条纹，在主动脉弓弯曲处以及腹主动脉的血管分岔处这样的几何形状急剧改变的区域病变特别明显，图像分析软件分析结果表明高脂高胆固醇饮食组主动脉病变区占整个主动脉面积的（27.6±7.8）％，而普通饮食组主动脉无脂质条纹病变。见图5所示。
图5 主动脉脂质条纹染色（苏丹Ⅳ染色）。A为普通饮食组，B为高脂高胆固醇组
2.5剪切应力对颈总动脉病理形态的影响
结果显示，4周后，普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组未套环的对照侧血管内膜完整，中膜含有大量梭形平滑肌细胞，在血流动力学改变的狭窄近心端以及远心端均有明显的内膜增生，近心端增生内膜内存在大量圆形空泡样的泡沫细胞，远心端增生的内膜主要为平滑肌细胞。高脂高胆固醇饮食组与正常饮食组病理形态基本一致，但病变更为严重，在狭窄的近心端有明显的复合斑块形成。（如图6）
正常饮食组 高脂高胆固醇饮食组
图6.颈总动病理组织改变(HE×200).I为内膜，M为中膜，A为外膜。
表2 血管内膜增生 (μm)
| 分组 |
近心端 |
远心端 |
对照侧 |
| 普通饮食组 |
90.3±21.6 |
38.5±12.7 |
— |
| 高脂高胆固醇饮食组 |
383.5±51.4 |
165.6±28.3 |
— |
a：p<0.05 和右侧对照比较 b：p<0.01 高脂饮食组和普通饲料组相比
2.6 弹力纤维的改变
4周后，狭窄近心端、狭窄段以及狭窄远心端的弹力纤维发生明显的改变，表现为近心端弹力纤维排列紊乱，内弹力板断裂，高脂高胆固醇饮食组更为明显，远心端弹力纤维紊乱，但内弹力板完整。而普通饮食组和高脂高胆固醇组对照侧血管的内弹力板完整，排列有序。
2.7 颈总动脉血管壁脂质蓄积
如图8所示，油红O染色可见狭窄近心端、狭窄段以及狭窄远心端均有染成红色的大量脂滴，而右侧对照组未见红染的脂滴。狭窄近心端脂质主要沉积于增生内膜，而远心端的脂质沉积主要位于血管的中膜。相对于狭窄的远心端，狭窄近心端的脂滴更多，更大。
正常饮食组 高脂高胆固醇饮食组
图8 颈总动脉血管壁脂质（油红O×200）。箭头所指为红染脂质。
2.8 颈总动脉血管壁胆固醇含量
颈总动脉狭窄后，普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组狭窄近心端和远心端血管壁胆固醇含量均上升，普通饲料组狭窄近心端为7.6±2.1 mg/g，远心端胆固醇含量为5.6±1.8 mg/g，而对照侧仅为1.3±0.5 mg/g；高脂高胆固醇饲料组胆固醇含量更高，狭窄近心端为12.7±3.1 mg/g，远心端为8.7±1.9 mg/g，而对侧对照组仅为1.5±0.4 mg/g，与对侧对照相比，差异具有显著性（P<0.05）。
表3. 颈总动脉血管壁胆固醇含量 (mg/g)
| 组 |
狭窄近心端 |
狭窄段 |
狭窄远心端 |
右侧对照 |
| 普通饲料组 |
7.6±2.1a |
1.5±0.5 |
5.6±1.8a |
1.1±0.5 |
| 高脂高胆固醇组 |
12.7±3.1 ab |
3.2±1.1 |
7.2±2.4ab |
1.3±0.6 |
注 a：P<0.05，与右侧相比 b：P<0.05 高脂高胆固醇饲料组与普通饲料组比
3. 讨论
血流动力学与心血管疾病特别是动脉粥样硬化关系密切，血液在血管中流动对血管壁产生流动剪切力、周向应力和压应力，其中流动剪切应力在心血管系统的病理和生理中起着非常重要的作用[7-9]。研究表明，血管壁切应力的减低和增大，血流形态异常如非层流状态、湍流、边界层血流分离等血流动力学因素均可能与动脉粥样硬化密切相关[10]。Depaola等[11]认为较大的剪切力梯度能诱导内皮细胞功能的改变，从而有可能导致内膜增生的形成。Tardy等[12]人发现动脉易损部位与该处的剪切力梯度有着密切关系，认为剪切力梯度对内皮层血管重构起着重要作用。Dirksen[13]通过对尸解的33个颈动脉斑块的研究结果表明，在下游区67％的斑块含有较多的平滑肌细胞，在上游区67％的斑块有较多的巨噬细胞，9个破裂的斑块6个发生在上游区，上游和下游斑块中细胞成分的差异提示了血流动力学在其中的作用。
邓小燕等[14]采用数值计算的方法探讨了狭窄度分别为30%、40%、50%以及60%的狭窄对动脉粥样硬化形成和发展的影响，认为当狭窄度小于40%时，狭窄度的增加促进动脉粥样硬化的发展，当狭窄度大于40%时，随着狭窄度的增加可能抑制动脉粥样硬化进程。为了进一步探讨剪切应力对血管内膜增生和动脉粥样硬化的影响，我们采用外科手术的方法，在兔的左颈总动脉处套环作一狭窄度为40%的局部狭窄，使该处的血流流场发生改变，而改变局部的血管壁的剪切应力，探讨血管内膜增生和动脉粥样病变的血流动力学机制。
我们的数值模拟结果表明，兔颈总动脉套环形成局部狭窄，血液流动在狭窄处受到严重干扰，在狭窄的近心端和远心端发生明显的切应力异常。壁面剪切应力在狭窄处的近心端稍微降低，然后突然升高达到峰值，在狭窄段入口处急剧下降，但依然明显高于平直段血管壁的剪切应力值。在狭窄的远心端剪切应力迅速下降，达到接近于零，尔后又缓慢回升，逐步回复到无扰动层流的值。在实验中我们发现不管是正常饮食组还是高脂高胆固醇饮食组狭窄的近心端和远心端都有明显的内膜增生和动脉粥样硬化斑块形成，病变部位主要是大量增殖的平滑肌细胞、泡沫细胞和以胶原纤维为主的结缔组织。HE染色结果表明狭窄的近心端病变远较狭窄远心端严重，并且狭窄近心端动脉粥样硬化斑块含有大量泡沫细胞，而狭窄远心端主要为平滑肌细胞的增生，近心端显著增加的泡沫细胞和脂质显示了高的切应力与斑块的不稳定性之间的关系，远心端大量的增生的平滑肌细胞则显示了振荡的低剪切应力提供斑块进行性增长的背景。
在实验中油红O染色和高效液相色谱检测表明不管在正常饮食组还是普通饮食组在狭窄的近心端还是远心端的动脉粥样硬化性病变处均有大量的脂质沉积。由于狭窄近心端为高剪切应力区域，Fry认为高剪切应力使动脉内皮细胞层容易受到损害,而使得血脂质容易在损伤处沉积而促进动脉粥样硬化的形成。狭窄远心端为振荡的低剪切应力区域，在该区域可能形成局部的致动脉粥样硬化性脂质的堆积[15-17]，低切应力将影响内皮细胞的形态和功能改变,同时振荡的剪切应力可能导致内皮细胞疲劳从而损伤内皮细胞，导致脂质跨内皮转运以及内皮下沉积增加[18]，从而促进动脉粥样硬化的形成和发展。
为了进一步探讨剪切应力对动脉粥样硬化发生发展的作用，我们比较了高脂高胆固醇饮食以及普通饮食两组动物的动脉粥样硬化病变情况，结果表明，在高脂高胆固醇组以及普通饮食组的病理改变特性基本一致，但高脂高胆固醇组病变比普通饮食组病变更为严重，脂质沉积更为显著。
据此我们推测，狭窄近心端形成高剪切应力区，高剪切力梯度损伤内皮细胞，使内皮细胞间隙增大，脂质以及炎症细胞容易进入内皮下沉积，最终引发内膜增生和粥样斑块的形成，为一个急性反应的过程，并且导致斑块的不稳定性。而在狭窄远心端由于是振荡的低剪切应力区，影响着脂质在该区域的堆积从而影响内皮细胞的通透性，导致脂质在内皮下沉积，引起平滑肌细胞的迁移和增殖，从而诱导内膜增生的形成和发展，为一个慢性反应过程。
综上所述，我们认为，剪切应力特性与斑块的发展以及组成密切相关，而高脂高胆固醇促进和加速新生内膜的发生、发展。
参考文献
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 剪切应力特性对血管内膜增生及动脉粥样斑块形成的影响
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