目的：探讨普伐他汀对在免疫调控中起重要作用的人单核细胞源树突状细胞（DC）免疫功能的影响。
方法：采用免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞，经含重组粒细胞一巨噬细胞刺激因子（100 ng／m1）和重组白介素（rhIL）－4（20 ng／m1）的Cellgro培养，使其分化为DC。DC与5O～100 tLmol／I普伐他汀孵育72 h后，采用流式细胞术检测DC表型（cD1a、CD40、CD86、HI A－DR），混合T淋巴细胞反应检测DC对淋巴细胞增殖的影响，采用酶联免疫吸附试验法检测细胞培养上清液中Thl／Th2[白介素（IL）－12、干扰素（IFN）－7／II－2、IL－10）细胞因子的浓度。
结果：与对照组相比，经普伐他汀处理的DC可下调CD80、CD86、HI A－DR和CDla的表达，对T淋巴细胞增殖作用明显减弱，明显抑制DC Thl细胞因子IL－12和IFN－7的分泌（P<O.05），但对TH2细胞因子IL－2和IL－1O水平无明显影响。100ΜMOL／L甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用。
结论：普伐他汀可明显抑制DC的成熟和免疫活性，此作用与甲羟戊酸途径有关。这可能是他汀类药物免疫调节的新机制。
近年他汀类药物与调脂无关的额外益处（即非调脂作用）越来越受到人们的重视，对其研究亦日渐增多。他汀类药物具有强大的“多效性”[1]。具有亲水性而代谢途径不经过细胞色素P450的普伐他汀有良好的免疫调控作用，被广泛应用到心脏移植后的患者，并能改善预后。其机制可能与抑制可诱生主要组织相容性复合体（MHC）－II及随后的T淋巴细胞活化有关[2]。本研究旨在探讨普伐他汀对在免疫调控中起重要作用的树突状细胞（DC）免疫功能的影响，以期发现他汀类药物免疫调节的新靶点、新机制。
材料与方法
一、主要试剂
CD14+免疫磁珠及相关产品购自Milteny Bio－tech公司，重组粒细胞一巨噬细胞刺激因子（rhGMCSF）和重组白介素（rhIL）一4购自R&D公司，淋巴细胞分离液（Histopaque_1077）、脂肪多糖（LPS）和丝裂霉素C购自Sigma公司，T淋巴细胞分离柱购自Cedar lane公司，单克隆抗人抗体CD1a、CD80、CD86、HLA－DR以及IgG荧光标记二抗购自BD公司，白介素（IL）一12、IL－10、干扰素（IFN）－7和IL－2的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自Bio－source公司。DC完全培养液包括DC Cellgro（Medi－atech公司）和10胎牛血清（Hyclone公司）。
二、DC的培养及分组
取正常人外周血，经淋巴细胞分离液（His－topaque一1077）密度梯度离心分离出单个核细胞，采用无Ca、Mg PBS洗3次后重悬，加入Fc拮抗剂和CD14+磁珠，4℃孵育20 min，经分离柱流洗，分选出纯度>96％的CD14+单核细胞；加入含rhGM－CSF（100 ng／m1）、rhIL一4（20 ng／m1）、10胎牛血清的完全培养基DC Cellgro，隔天换液；第5天分别加入50、100μmol／L普伐他汀或100mol／L甲羟戊酸、100 mol／L普伐他汀+甲羟戊酸孵育72 h后，以PBS作为阴性对照。72 h收集悬浮细胞和上清液。
三、DC表型检测
DC采用LPS（1 g／mL）诱导成熟，收集的细胞调整浓度为5×10 ／ml，加入异硫氰吸萤光素（FITC）荧光标记的一抗，于4°C孵育30 min，PBS洗2遍后悬于荧光标记液中，应用流式细胞仪FACS calibar及其分析软件检测分析。
四、混合T淋巴细胞增殖反应
分离正常人外周血单个核细胞，按说明书要求应用T淋巴细胞柱分离出T淋巴细胞，应用RP－MI 1640调整细胞浓度为2×10。／ml，加入96孑L板，每孑L 100l。干预后的DC经丝裂霉素C于37℃处理1 h，悬于完全培养基，按不同细胞浓度（1×103～1×105／m1）100μ1／：fL加入96孑L板与T淋巴细胞混合，每组设3个复孑L，培养96 h。结束前16 h加入3H－TdR（0.5μci／孔），采用纸片法收集细胞，应用液闪仪检测放射线核数（CPM）值。
五、细胞因子检测
干预72 h后收集细胞培养上清液，置于－7O℃储存，采用ELISA法测定II－2、IL－10、IFN－7和IL－12浓度。
六、统计学处理
采用配对t检验。
结 果
一、DC的培养和检测
（一）形态学观察磁珠分离的单核细胞均匀一致，纯度达96％以上，最初呈贴壁样生长；第2天大部分细胞悬浮，并聚集成集落样生长；第3天见细胞毛刺生成，逐渐增多，各组的细胞形态均无明显区别。
（二）表型分析干预前的表型表现为未成熟DC，经LPS光诱导后，DC成熟标记（CD1a、CD80、CD86和HLA－DR）表达明显增强，提示已分化成为成熟的DC，但50、100 gmol／I普伐他汀可抑制LPS诱导的DC成熟，100mol／I甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用。见表1。
（三）混合T淋巴细胞增殖反应经过LPS处理的DC，少量细胞（1N 10个／孑L）就可以激发强烈的异种T淋巴细胞的增殖反应，随着细胞数的增多，促增殖作用增强，但3×10个／孔时与1N10／孑L个基本一致，PBS组DC细胞促增殖作用明显弱于LPS组。100tμmol／L普伐他汀可减弱LPS的作用，同等浓度的甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用。
（四）细胞培养上清液细胞因子的检测50、100μmol／L普伐他汀可明显抑制IX；分泌Thl细胞因子IL－12和IFN－7，但对Th2细胞因子IL－2和IL－10的分泌无明显影响。100 mol／L甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用。见表2。
讨 论
目前，有研究提示他汀类药物具有免疫调节作用，但具体机制尚不清楚。离体实验中，他汀类药物能抑制人内皮细胞和单核细胞一巨噬细胞MHC－Ⅱ表达，普伐他汀与环孢霉素对细胞毒T淋巴细胞的活性有协同作用[3]。临床研究发现，心脏移植患者经普伐他汀治疗后，1年成活率明显增加，移植血管病事件和急性重症移植排斥事件明显减少[2]。同样，普伐他汀能明显降低肾移植患者急性移植器官排斥事件和多器官排斥事件的发生率，还可降低自然杀伤细胞的细胞毒性[4]。DC是目前发现的机体内功能最强的专职抗原呈递细胞，广泛分布于淋巴器官和非淋巴器官，极少量的DC即可强烈激活T淋巴细胞启动特异性细胞免疫反应，其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的1OO～10000倍[3]，在免疫应答的诱导和调节中起重要作用。不同成熟状态DC的功能不同，未成熟的DC工、Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量低，不能激活T淋巴细胞，但有强大的捕获及加工处理抗原的能力，一旦捕获抗原后会转化为成熟形式，此时其工、Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量增高，捕捉抗原的能力下降，而加工、呈递抗原、激活T淋巴细胞的能力则增强。
本研究发现，经普伐他汀处理的DC可下调CD80、CD86、HLA－DR和CD1a的表达，对T淋巴细胞增殖作用明显减弱，明显抑制DC Thl细胞因子IL－12和IFN－7的分泌（P<0.05），但对Th2细胞因子IL－2和IL－10水平无明显影响。100μmol／L甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用，表明普伐他汀可明显抑制DC的成熟和免疫活性。许多他汀类药物的多效性作用，都不作用于3－羟基－3一甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶，而是继发于甲羟戊酸通路的中间产物异戊烯类的生物合成，如焦磷酸法尼酯（FPP）和牛儿基牦牛儿基二磷酸化合物（GGPP），这完全独立于细胞内胆固醇的生物合成。异戊烯类是细胞内信号传导通路中的许多蛋白转录后修饰的重要固定物。这些蛋白包括小GTP结合蛋白，在调节细胞生长和分化、基因表达、细胞骨架组装、细胞流动性、蛋白和脂质流动、核转移及宿主防御方面起关键作用。大多数小GTP结合蛋白如Rho、Rac、Rab和Rap的激活需要GGPP，仅有极少数需要焦磷酸法尼酯化，如Ras。本研究也发现，普伐他汀抑制DC免疫活性的作用与甲羟戊酸途径有关。这可能是他汀类药物免疫调节的新机制。
此外，普伐他汀抑制DC免疫活性的作用，也进一步丰富了他汀类药物抗动脉粥样硬化的非调脂作用。炎症和免疫反应在动脉粥样硬化发生及斑块稳定性中起重要作用。新近在血管组织中发现有血管树突状细胞（VDCs）存在，正常的动脉壁中VDCs较少，属未成熟形式，主要分布在血管的内膜和外膜；VDCs在动脉粥样硬化（AS）病变中聚集明显增加，在炎症浸润区域往往与T淋巴细胞和巨噬细胞聚集在一起[6，7]。最近的研究显示，氧化修饰的低密度脂蛋白和尼古丁可通过激活DC介导的获得性免疫反应，促进AS病变的进展[8，9]，表明VDCs参与AS的病理发生。先前的研究证实，过氧化物酶体增生激活型受体丫激动剂环格列酮可抑制氧化修饰低密度脂蛋白诱导的人单核细胞源DC的免疫功能[10]，普伐他汀可上调过氧化物酶体增生激活型受体7的表达[11]，从而推测普伐他汀可能会通过直接抑制或间接作用于过氧化物酶体增生激活型受体7两种途径，抑制DC的免疫活性和功能，达到抗动脉粥样硬化和稳定斑块的目的。
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