| 动脉粥样硬化遗传易感性与YNZ22多态性的相关性 |
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| 作者：郑强荪 赵… 文章来源：《第四军医大学学报》2001年10月22卷19期 点击数： 更新时间：2007-9-14 |
摘 要：目的 研究YNZ22基因多态性在陕西地区老年动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）人群中分布规律及其该位点与AS遗传易感性的关系。 方法 应用多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对94例老年AS患者及75例非AS老年人YNZ22-VNTR（可变数目串联重复序例vari-able number tandem repeats）位点进行多态性分析。 结果 在正常人群中YNZ22位点共检测出20种基因型，9个等位基因，其片段大小在168～798bp之间，杂合度为24.0%，多态信息量（polymorphism information content，PIC）为0.8372；AS人群中YNZ22基因点共检测出23种基因型，9个等位基因，其片段大小在168～728bp之间，杂合度为24.5%，多态信息量（PIC）为0.8067。它们的基因频率分布有差异。另外，在正常人群与AS人群中，小片段的频率有显著差异。最重要的是发现基因频率和基因型频率在两群体中不同。 结论 YNZ22位点可能可以作为AS的遗传标记。
引言
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS），是一种以细胞增殖和变性为主要病变的疾病，其中内皮损伤和动脉平滑肌细胞（SMC）及巨噬细胞增殖起着重要的作用，它严重地威胁着人类的健康，是一种常见于老年人群中的疾病，它也是许多心脑血管疾病发生的重要病理基础。它的发病机制十分复杂，包括有基因的控制也有环境因素等的影响。YNZ22基因（又名DI7S5，D17S22，DIS22，D17S30，D17S1167，UT83），位于17p13.3，与p53基因紧密连锁，是17p末端杂合性较高的多态标记位点，Wolf等[1] 发现该点是由70bp重复单位多拷贝组成，其核心序列为TGGAGTCTCTGGGTGTCGTGCTCAGAGT，呈现高度的可变数目串联重复多态性.VNTR与肿瘤之间的研究较多的是YNZ22-VNTR位点，该位点常常被用作标记用于肿瘤杂合性丢失（loss of het-erozygosity，LOH）的研究，在各种肿瘤的研究中都发现YNZ22-VNTR和p53是常见的缺失区域，直肠癌，恶性色素瘤与乳腺癌的YNZ22-VNTR均发现的缺失情况，乳腺癌有60%在YNZ22-VNTR的缺失[2，3，4] 。迄今国内外尚未见到关于VNTR-YNZ22位点多态性分布与AS相关性研究的报道，故我们应用PCR-VNTR技术比较了解陕西地区老年AS人群与非AS人群YNZ22位点等基因多态性分布，试图阐明YNZ22能否成为AS群体中理想的遗传易感性标记，并且阐明AS的产生机制是否和抑癌基因的缺失有关。
1 对象和方法
1.1 对象
无血缘关系的AS陕西中老年人群外周血样94例（年龄60～50岁，其中心肌梗死62例，余32例均经冠状动脉造影证实有狭窄或血管多普勒超声发现有粥样斑块）.无血缘关系的非AS老年人群外周血样75例（年龄62～74岁，均经冠状动脉造影或血管多普勒超声查证无狭窄或粥样斑块）。标本均为唐都医院心内科提供。
1.2 方法
常规酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA.PCR引物：5'-CGAAGAGTGAAGTGCAC-AGG-3'和5'-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3'（赛百盛公司）.总反应体积为30μL，内含dNTP200λmol・L-1 ，引物各25pmol・L-1 ，Taq DNA聚合酶（华美生物工程公司）2u，模板DNA约5μg，5μl Buffer缓冲液，Mg
2+ 1.8μL，石蜡油30μL.PCR程序：97℃变性7min，95℃4min中加Taq酶，55℃退火1min，72℃延伸2min，进入循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，循环30次后72℃再延伸10min（PCR仪为P3公司480型）.扩增产物在20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳后，以100bp DNA在Ladder（华美生物工程公司）为标准判型.在紫外检测仪下观察并照相。
数据处理统计：基因型及等位基因频率用直接算法，并按Hardy-Weinberg平衡原理确认样本的群体代表性；组间基因型及等位基因频率差异用χ2 检测；观察杂合度（heterozygosity observed，HO）和多态信息量（polymorphism information ontent，PIC）按下列公式计算：PIC=1-Σ9i=1 x i2
2 结果
2.1 陕西正常老年人群YNZ22位点等位基因的多态性
75例陕西正常老年人群中共检测出YNZ22位点9个等位基因.片段大小在168～798bp之间，依据重复单位重复次数不同将等位基因依次命名为A1，A2，A3…（A为allele缩写）.基因频率在0.0133～0.2600之间，最常见的等位基因是A4，少见的是A8。检测出的20种基因型中，最常见的是A4/A4，其次是A1/A1，A2/A2。杂合度为24.0%，多态信为83.7%。
2.2 陕西AS老年人群YNZ22位点等位基因的多态性
94例陕西AS老年人群中检测出YNZ22位点9个等位基因。片段大小在168～728bp之间，基因频率在0.0053～0.3245之间，最常见的等位基因是A1，少见的是A9。检测出的23种基因型中，最常见的是A1/A1，其次是A2/A2，A4/A4。杂合度为24.5%，多态信为80.7%。
2.3 陕西正常老年人群与AS老年人群YNZ22位点等位基因的多态性分布比较
对检测出的对应等位基因的频率分布统计分析表明：正常老年人群与AS老年人之间有差异（χ2 =17.7371，自由度n=9，P<0.05）（利用NOSA软件）。
3 讨论
因AS发生心、脑血管意外事件导致死亡居疾病死亡率中的首位，近年来，在我国该病的发生也有增高的趋势。但AS的病因及发病机制尚未清楚，属多基因遗传病.动脉内膜增厚、平滑肌细胞迁移与增殖是AS形成过程中的关键，抗癌基因在调节增殖和表型转化方面可能起重要作用[5，6] 。但AS群体的YNZ22基因多态性未见报道。YNZ22基因（17p13.3）是17p末端杂和性较高的多态遗传标记位点，Deka等[7] 在印度的Kachari人，加拿大的Dogrib地区印第安人，巴布亚新几内亚高地人，德国北部的高加索人中，共检测出YNZ22位点15种不同等位基因，杂合性从54.0%到89.0%。Gene等[8] 在西班牙加泰罗尼亚人中检测出14种不同的等位基因，56种基因型，杂合率为81.4%；Harashima等[9] 在日本人中检测出10个不同的等位基因，杂合率为83.5%；Laszik等[10] 在来自布达佩斯的高加索人中检测出13个不同的等位基因，51种基因型，杂合率为80.0%；我们在陕西正常人群中共检测出9个等位基因168～798bp，20种基因型，多态信息量为83.3%。这表明YNZ22在陕西正常人群中为高度多态性位点，可提供的信息量大。片段小的基因在正常人群中比在AS人群中的频率低，而大片段基因则正常人群中比AS人群中的基因频率高。A4基因的频率在正常人群中为0.2600，而A4基因在AS人群中频率为0.1649，约为1.6倍。携带A4基因的正常人的频率为25/75=0.3333，而携带A4基因的AS人的频率为20/94=0.21，也约为1.6倍。A1基因在AS人群中频率为0.3245，A1基因的频率在正常人群中为0.1733，约1.87倍，携带A1基因的正常人的频率为5/75=0.2000，携带A1基因的AS人的频率为34/94=0.3600，约为1.8倍。这说明AS的高发病率可能是由于短片段A1和A4基因多态性改变所致。另外，若以A4为线，在正常人群中小于448bp的占88.3%，大于448bp的占16.7%。在AS人群中小于448bp的占88.3%，大于448bp的占11.7%.这也说明AS的高发病率可能是由于短片段的多态性改变所致.我们还注意到，在正常人群中A10等位基因可被检测到，检测不到A9基因，而在正常人群中检测不到A10基因能检测到A9基因，因为A9，A10的频率分别为0.0053和0.0267，它不能说明AS与A9，A10有关.这说明YNZ22基因位点与AS有很大的相关性，可以作为AS的重要参考指标之一，AS的发病机制十分复杂，包括有基因的控制，也有环境因素的影响。
参考文献：
[1]Wolf PK，Nakamura Y，White R.Molecular characterization of a spontaneously generated new allele at a VNTR locus：No ex-change of flanking DNA sequence [J].Genomics，1998;3（1）：347-351.
[2]Kashkin KN，Fleishman EV，Chumakov PM，Perevoshchikov AG.Genetic alterations in the region of the p53gene on human chromosome17in colorectal cancer [J].Genetika，1998;34（8）：1049-1055.
[3]Thompson AM，Crichton DN，Elton RA，Clay MF，Chetty U，Steel CM.Allelic imbalance at chromosome17p13.3（YNZ22）in breast cancer is independent of p53mutation or p53overex-pression and is associated with poor prognosis at medium-term follow-up [J].Br J Cancer，1998;77（5）：797-800.
[4]Tomlinson IP，Gammack AJ，Stickland JE，Mann GJ，MacKie RM，Kefford RF，McGee JO.Loss of heterozygosity in malig-nant melanoma at loci on chromosome11and17implicated in the pathogenesis of other cancers [J].Genes Chromosomes Can-cer，1993;7（3）：169-172.
[5]Bennett MR，Macdonald K，Chan SW，Botle JJ，Weissberg PL.Cooperative interactions between RB and p53regulate cell prolif-eration，cell senescence，and apoptosis in human vascular smooth muscle cells from atherosclerotic plaques [J].Circ Res，1998;82（6）：704-712.
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[7]Deka R，De Croio S，Yu LM.Variable number of tandem repeat（VNTR）polymorphism at locus D17S5（YNZ22）in four ethni-cally defined human populations [J].Hum Genet，1992;90（1-2）：86-90.
[8]Gene M，Huguet E，Sanchez Garcia C，Moreno P，Corbella J，Mezquita J.Suitability of the YNZ22（D17S5）VNTR polymor-phism for legal medicine investigations in the population of Cat-alonia（Spain）[J].Int J Leagel Med.1995;107（4）：222-224.
[9]Harashima N，Ota M，Katsuyama Y.The allele frequency dis-tribution at VNTR locus D17S5（YNZ22）in a Japanese popula-tion sample [J].Nippon Hoigaku Zasshi，1996;50（4）：237-240.
[10]Laszik A，Weisser H，Keresztrry L，Pollak S.Allele frequen-cies for the VNTR locus D17S5（YNZ22）in Hungary [J].Int Legal Med，1999;112（5）：336.
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